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喹诺酮类抗菌药作为一种广谱抗生素，是人畜通用的药物，随着使用频率越来越高，细菌对其耐药性逐渐增强，耐药菌株呈现迅速增长的趋势，严重影响了喹诺酮类药物在临床上的治疗效果。目前中国的大肠杆菌等革兰氏阴性菌对喹诺酮类药物的耐药率显著高于其他国家。大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制有很多种，如作用靶位点和编码基因的改变、携带质粒耐药基因、细胞膜通透性改变、药物主动外排泵的作用等，其中起主导作用的是作用靶位点和编码基因的改变。在靶位点的改变中回旋酶和拓朴异构酶Ⅳ的特定突变会使得大肠杆菌对喹诺酮类药的耐药性增强。而目前的研究主要是针对喹诺酮耐药相关性的，对其因果关系的研究较少。本研究首先对580株临床分离的大肠杆菌进行萘啶酸、恩诺沙星、环丙沙星的耐药检测，并对其gyrA突变基因进行检测，从而分析其耐药相关性。再利用CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌标准株进行定点突变，研究大肠杆菌gyrA基因突变与喹诺酮耐药的因果关系。 一、GyrA基因突变与喹诺酮类耐药相关性研究 本研究采用世界卫生组织推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法，按CLSI(2012)判定标准，检测大肠杆菌对萘啶酸、环丙沙星、恩诺沙星这3种喹诺酮类药物的敏感性，以分析大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药率的情况。结果表明，大肠杆菌对喹诺酮类抗生素耐药率非常高，580株临床大肠杆菌样品对萘啶酸、环丙沙星、恩诺沙星的耐药率分别为75.34％(437/580)、47.07％(273/580)和48.62％(282/580)，说明临床分离的大肠杆菌对喹诺酮的耐药程度较强。利用荧光定量PCR及基因测序的方法，检测580株临床大肠杆菌样品中gyrA基因突变情况。根据基因测序结果发现，gyrA基因上第248、255、259、260、261、273、300位碱基发生突变。依照遗传密码子表，确定突变基因相应氨基酸改变，发现只有第83位氨基酸和87位氨基酸发生改变，而第255、273、300位碱基为无意义突变。本研究发现第83位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，第87位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸。其中突变率最高的为83Ser→Leu与87Asp→Asn同时突变，突变率达49.3％。在喹诺酮耐药率方面，83Ser→Leu与87Asp→Asn同时突变的耐药率也是最高的，说明其耐药相关性强。 二、基于CRISPR/Cas9技术研究大肠杆菌GyrA基因突变与喹诺酮类药物耐药性因果关系 利用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌ATCC25922的gyrA基因进行突变，以及对大肠杆菌临床株进行反向突变，从而研究大肠杆菌gyrA基因突变与喹诺酮耐药的因果关系。由于gyrA基因中与喹诺酮耐药相关性较大的氨基酸位点为83和87位点，故利用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌标准株gyrA基因的第248位点和259位点进行突变，对大肠杆菌临床株248位点进行突变。最终获得突变株E.coliATCC25922 S83L（标准株氨基酸83由丝氨酸变为亮氨酸）、E.coli ATCC25922 D87Y（标准株氨基酸87由天冬氨酸变为酪氨酸）、E.coliATCC25922 S83L&D87N（标准株氨基酸83和87分别由丝氨酸变为亮氨酸和天冬氨酸变为天冬酰胺）、E.coli S462231 L83S（临床株氨基酸83由亮氨酸变为丝氨酸）。并利用生长曲线实验、最小抑菌浓度实验和药敏实验对突变株进行喹诺酮耐药性分析，结果表明，gyrA基因突变与喹诺酮耐药存在因果关系。 综上所述，本研究对580株临床分离大肠杆菌进行喹诺酮耐药性检测，并研究gyrA基因突变与耐药之间的相关性。以及利用CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌标准株和临床株进行基因突变，从而研究大肠杆菌对喹诺酮耐药的因果关系。本研究从基因水平研究大肠杆菌对喹诺酮的耐药情况，为大肠杆菌对喹诺酮的耐药机制的研究提供了更多的理论依据。