论文部分内容阅读
脂肪细胞成脂分化的分子机制的研究,关系到人类肥胖的防治及提高动物生产效益的策略。本研究通过猪脂肪间充质干细胞(AMSCs)的分离培养和纯化、成脂诱导分化、实时定量PCR等技术,检测了AMSCs成脂分化过程中Krüppel样因子4和7(KLF4、KLF7)的表达模式,并检测分析姜黄素对猪AMSCs诱导分化及对KLF4和KLF7表达模式的影响,获得了如下结果: 1.猪AMSCs的分离培养和成脂诱导分化 采集15日龄仔猪颈部的脂肪组织,用I型胶原酶消化分离单细胞,经原代和传代培养分离纯化AMSCs。选取F3代猪AMSCs,用成脂诱导培养液诱导分化,用油红O染色法检测AMSCs的成脂分化程度。结果发现,诱导培养3 d后个别细胞开始出现小脂滴,随着诱导时间的增加,出现脂滴的细胞数量及细胞内的脂滴含量逐渐增多;诱导10 d后小脂滴逐渐汇集成较大脂滴;诱导分化第18 d,成脂分化率达60%。 2.猪AMSCs成脂诱导分化中KLF4和KLF7的表达模式 取F3代AMSCs成脂诱导分化不同时间,用荧光定量PCR检测KLF4和KLF7的表达模式。结果显示,诱导0 d、2 d、4 d、8 d、12 d和16 d的 KLF4的表达量分别为对照组的1.67、2.68、2.63、2.36和2.62倍;诱导6 h、12 h、24 h和48 h后KLF7的表达量分别为对照组的0.49、0.33、0.22、0.22倍。这些结果表明,KLF4的表达在猪AMSCs成脂诱导分化的第2 d就有显著上调,表达高峰出现在成脂分化的第4 d,此后持续高表达,表现出持续性的调控作用;KLF7在成脂诱导开始时就有显著的表达,随着成脂诱导时间的增加表达量逐渐减少,表现出在未分化状态下抑制分化调控作用。 3.姜黄素对猪AMSCs成脂分化的影响 取F3代猪AMSCs进行增殖培养,当细胞汇合度达90%时,分别用含5μM、10μM、15μM、20μM和25μM浓度姜黄素的成脂诱导液作用24 h后,更换成脂诱导培养液进行诱导分化。诱导10 d后,用油红O对细胞进行染色并用异丙醇萃取法检测细胞内脂肪的含量。结果显示,所用的所有姜黄素浓度均能显著地抑制(P<0.05)细胞的成脂分化,其中5μM浓度的姜黄素诱导液的抑制率为6.3%,而25μM抑制率能达到61.53%。 4.姜黄素对猪AMSCs成脂分化过程中KLF4和KLF7表达模式的影响 取F3代会和度达80%的猪AMSCs细胞,用含25μM的姜黄素的成脂诱导液作用24 h,然后更换成脂诱导液,诱导0d、2d、4d、8d、12d、16d和0h、6h、12h、24h、48h,用Real-timePCR分别检测姜黄素对猪AMSCs成脂分化过程中KLF4和KLF7 mRNA表达模式的影响。结果发现,姜黄素能够显著下调0 d、2 d、4 d、8 d、12 d、16 d的KLF4 mRNA的表达,下调率分别达到29.95%、73.02%、54.90%、53.76%和39.10%;显著上调0 h、6 h、12 h、24 h、48 h的KLF7 mRNA的表达,上调率分别达到37.49%、92.71%、159.10%和138.86%。这些结果证明,姜黄素通过下调KLF4 mRNA的表达和上调KLF7mRNA的表达来实现对成脂分化的抑制作用。