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研究背景与目的巨噬细胞是先天免疫的重要组成之一,根据功能和表型可分为两种:经典激活的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞[1]。M2型巨噬细胞由Th2细胞因子IL-4和IL-13以及其他细胞因子IL-10、IL-33等刺激激活,可高表达Arg-1,MR,Fizz1,YM1等细胞因子[2],具有抑制炎症、促进肿瘤生长转移侵袭、组织修复、血管形成等功能[3]。肿瘤微环境中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAMs）,大部分TAMs表现出M2型巨噬细胞的特性。以TAMs为靶点治疗癌症有望成为一种新的治疗策略[4]。醉茄素A（Withaferin A,WA）是从药用植物南非醉茄中提取的甾体内酯,已被证实具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、抗血管生成等功能[5,6]。近年来的研究表明,WA可能成为非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌等癌症潜在的治疗方案[7,8]。本课题组前期的研究结果发现:脂多糖刺激的巨噬细胞产物,可以通过抑制NF-κB通路的作用,增强WA诱导的人乳腺癌细胞凋亡[6]。鉴于文献中报道的WA的抗炎和免疫调节的作用[8],WA对肿瘤微环境中的TAMs的极化状态是否有一定作用,尚未见报道。STAT6信号通路是M2型巨噬细胞极化过程中最重要的信号通路之一[9]。因此我们拟探讨WA对肿瘤微环境中M2型巨噬细胞极化的影响以及STAT6信号通路在其中的作用。本研究选用小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7作为研究对象。先用IL-4极化两种细胞观察WA对巨噬细胞极化的作用;再选用人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的条件培养基（conditioned medium,CM）,模拟肿瘤微环境,观察巨噬细胞暴露于肿瘤条件培养基的极化状态及WA对其的影响,探讨WA对肿瘤微环境中的巨噬细胞的作用,同时检测上述影响因素下STAT6信号通路的改变,初步探讨WA对巨噬细胞极化状态影响的作用机制。研究方法（1）首先观察WA对小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7的细胞增殖存活率的影响,选用不同浓度的WA（1,2.5,5,10μM）处理细胞12h,通过MTS法观察WA对两种巨噬细胞增殖存活率的影响。（2）观察WA对IL-4处理的小鼠腹腔巨噬细胞极化状态的影响,设立DMSO对照组（对照组）,IL-4组（20ng/ml）、WA组（1μmol/ml）、WA+IL-4组,通过Western blotting方法和qRT-PCR方法检测WA对M2型巨噬细胞相关细胞因子Arg-1和MR的作用。（3）观察WA对MDA-MB-231CM处理的小鼠腹腔巨噬细胞极化状态的影响,设立对照组、MDA-MB-231CM组（100%）,WA组、WA+231CM组;观察WA对MCF-7CM处理的小鼠腹腔巨噬细胞极化状态的影响,设立对照组、MCF-7CM组（100%）、WA组和WA+MCF-7CM组,通过Western blotting方法和qRT-PCR方法检测WA对M2型巨噬细胞相关细胞因子Arg-1和MR的作用。（4）观察WA对IL-4处理的小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7极化状态的影响,设立对照组、IL-4组、WA组、WA+IL-4组;观察WA对两种人乳腺癌细胞CM处理的Raw264.7细胞极化状态的影响,设立对照组、MDA-MB-231CM组,MCF-7CM组、WA组、WA+MDA-MB-231CM组和WA+MCF-7CM组,通过Western blotting方法、qRT-PCR方法和流式细胞术检测WA对M2型巨噬细胞标志因子Arg-1和MR/CD206的作用。（5）观察WA对IL-4处理的两种巨噬细胞的STAT6通路的影响,分别设立对照组、IL-4组、WA组、WA+IL-4组,通过Western blotting方法检测WA对STAT6信号通路中的STAT6和p-STAT6蛋白的作用。（6）观察WA对两种人乳腺癌细胞CM处理的两种巨噬细胞的STAT6信号通路的影响,分别设立对照组、MDA-MB-231CM组、MCF-7CM组、WA组、WA+MDA-MB-231CM组和WA+MCF-7CM组,通过Western blotting方法检测WA对STAT6信号通路中的STAT6和p-STAT6蛋白的作用。结果（1）1μmol/ml的WA对细胞的存活率无明显影响;WA浓度在2.5μmol/ml以上时,两种细胞的存活率明显下降。（2）与对照组相比,小鼠腹腔巨噬细胞的IL-4组的M2型巨噬细胞相关细胞因子Arg-1和MR表达明显增加;与IL-4组相比,小鼠腹腔巨噬细胞的WA+IL-4组的Arg-1和MR表达明显降低。（3）与对照组相比,小鼠腹腔巨噬细胞的MDA-MB-231CM组、MCF-7CM组的Arg-1和MR表达明显增加;与MDA-MB-231CM组、MCF-7CM组相比,小鼠腹腔巨噬细胞的WA+MDA-MB-231CM组和WA+MCF-7CM组的Arg-1和MR表达明显降低。（4）与对照组相比,小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7的IL-4组、MDA-MB-231CM组和MCF-7CM组的Arg-1和MR/CD206表达明显增加;与IL-4组、MDA-MB-231CM组和MCF-7CM组相比,Raw264.7细胞的WA+IL-4组、WA+MDA-MB-231CM组和WA+MCF-7CM组的Arg-1和MR/CD206表达明显降低。（5）各组的STAT6蛋白无明显变化。但与对照组相比,两种巨噬细胞的IL-4组p-STAT6蛋白表达明显增加;与IL-4组相比,两种巨噬细胞的WA+IL-4组的p-STAT6蛋白表达明显降低。（6）各组的STAT6蛋白无明显变化。但与对照组相比,两种巨噬细胞的MDA-MB-231CM组和MCF-7CM组的p-STAT6蛋白表达明显增加;与MDA-MB-231CM组和MCF-7CM组相比,两种巨噬细胞的WA+MDA-MB-231CM组和WA+MCF-7CM组的p-STAT6蛋白表达明显降低。结论（1）MDA-MB-231CM和MCF-7CM可介导小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7向M2型极化;WA明显抑制IL-4、MDA-MB-231CM和MCF-7CM介导的小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7向M2型极化。（2）WA可能是通过抑制STAT6信号通路的激活,抑制IL-4、MDA-MB-231CM和MCF-7CM介导的小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7向M2型极化。