疟疾是由疟原虫感染引起的最为严重的寄生原虫感染性疾病。严重的疟疾疫情正是造成发展中国家儿童高死亡率和成人高发病率的主要原因。而疟原虫抗原变异和耐药性原虫的出现，又进一步阻碍了疟疾疫苗的研制和抗疟药物的开发。因此，寻求新的疟疾疫苗靶点将无疑是疟疾控制的重中之重。　　 啮齿类疟原虫感染小鼠为深入探讨抗人疟保护性免疫应答机制，提供了一种宝贵的实验动物模型。约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染的不同小鼠，会呈现不同的Th1细胞免疫应答模式，因而导致其出现自愈和死亡两种截然相反的感染结局。因此，疟疾感染早期Th1细胞免疫应答的有效建立明显影响着感染进程和最终结局。在这一过程中，DCs是决定Th免疫应答的关键效应细胞。作为活化树突状细胞(dendritic cells，DCs)众多效应分子之一的Toll样受体（Toll like receptor，TLR）对于其成熟和功能发挥起着举足轻重的作用。同时啮齿类研究表明，TLR2/4可通过识别疟原虫锚定在糖复合物上的糖基化磷酯酰肌醇（glycosylphospatidylinositol，GPI）诱导炎症因子产生，而疟原虫成份之一的疟色素可通过TLR9启动天然免疫应答。　　 我们利用成功建立的P.y17XL感染的BALB/c和DBA/2鼠疟模型，分析了参与抗疟免疫应答调控的相关因素。前期的研究结果显示，两种不同易感性的小鼠在感染过程中，TLR4/9表达程度不尽相同。本研究通过外源性给予TLR4/9激动剂或抑制剂，动态观察其对于不同易感性小鼠感染模式及结局的影响、免疫效应细胞及产生细胞因子的变化，以期为疟疾疫苗开发提供新的靶点。　　 实验方法：　　 1、实验动物、疟原虫及主要试剂　　 6～8周龄、雌性BALB/c小鼠、DBA/2小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供（许可证编号：SCXK京200420001）；P.y17XL（同本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠）；LPS购自Sigma公司(St. Louis，MO，USA)；TLR9激动剂CpG1826及其对照组CpG1982（Takara合成）；TLR9抑制剂H154及其对照组A151(Takara合成)。　　 2、动物分组与TLR4/9激动剂抑制剂处理及感染　　 (1)P.y17XL不同易感程度鼠疟模型：易感型BALB/c小鼠和抵抗型DBA/2小鼠；　　 (2)TLR9激动剂及其对照组处理组模型：感染前2d，分别经胫骨前肌肉注射给易感型BALB/c小鼠：TLR9激动剂易感型BALB/c小鼠；CpG1826，50μg/只；TLR9激动剂对照组CpG1982，50μg/只；　　 (3)TLR4激动剂处理组模型：感染后第2d易感型BALB/c小鼠经鼠尾静脉注射TLR4激动剂LPS，25μg/只；　　 (4)TLR9抑制剂及其对照组处理组模型：感染前1d，分别经腹腔注射给予抵抗型DBA/2小鼠：TLR9抑制剂H154，3mg/kg;TLR9抑制剂对照组A151，3mg/kg;　　 上述小鼠分别经腹腔感染1×106P.y17XL寄生的红细胞，感染不同时间小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率，并每同观察生存率。　　 3、脾细胞培养　　 不同鼠疟模型小鼠于感染0d、3d和5d常规无菌摘取脾脏，常规方法制备脾细胞悬液。用含10％FCS的RPMI1640调整脾细胞终浓度至1×107个/ml，24孔培养板(FALCON)，每孔加入500μl细胞悬液，一式3孔，培养48h。350×g室温离心10min，收集上清，-80℃保存，待细胞因子测定。　　 4、流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞检测　　 FACS检测CD11c+TLR4+DCs、CD11c+TLR9+DCs、CD11c+CD11b+DCs(mDCs)、CD11c+B220+DCs(pDCs)、CD4+CD69+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Tregs)。　　 5、细胞因子检测　　 双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清IFN-γ、IL-10的含量分别进行检测，酶标仪(InterMedNJ-2100)测定450nm处OD值。绘制标准曲线，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 6、统计学分析　　 使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验对数据做统计分析。　　 实验结果：　　 1、TLR4/9激动剂对P.y17XL感染BALB/c小鼠感染模式的影响　　 TLR4激动剂LPS处理组，与对照组相比，实验组小鼠原虫血症水平缓慢上升，于感染后第16d达到峰值，峰值为21.12％，生存率为66.67％。TLR9激动剂处理组，实验组及对照组小鼠原虫血症水平迅速持续升高，一同于感染后第5d达到60～70％，并于感染后第5d-7d全部死亡。　　 2、TLR4/9激动剂对抗Py17XL感染免疫过程中相关免疫细胞的影响　　 与感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染组小鼠脾脏表达TLR9的DCs细胞、DCs亚群及Tregs均显著升高，脾脏表达TLR4的DCs和脾脏细胞内CD4+CD69+T细胞未见有意义的变化。感染后3d和5d，TLR4激动剂LPS处理组小鼠脾脏表达TLR4的CD11c+DCs、DCs亚群及CD4+CD69+T细胞百分比显著高于正常感染组小鼠，Tregs百分比显著低于正常感染组。TLR9激动剂处理组小鼠脾脏表达TLR9的CD11c+DCs百分比显著高于正常感染小鼠及对照组。DCs亚群、CD4+CD69+T细胞及Tregs与之相比未见有意义的改变。　　 3、TLR4/9激动剂对P.y17XL感染免疫过程中相关免疫分子的影响　　 与感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-10分泌显著升高。感染后3d和5d，TLR4激动剂LPS处理后的感染小鼠在相应时间点上脾细胞培养上清中IFN-γ显著高于正常感染组，IL-10的分泌量显著低于正常感染组。TLR9激动剂与之相比脾细胞培养上清中IFN-γ及IL-10未出现有意义的变化。　　 4、TLR9抑制剂对P.y17XL感染DBA/2小鼠感染模式的影响　　 经P.y17XL感染后第2d，所有小鼠外周血中均出现疟原虫感染的红细胞。未经TLR9抑制剂H154处理的小鼠原虫血症水平上升平缓，于第6d和第14d达到峰值，峰值分别为15.56和15.57。随后小鼠全部自愈。而经TLR9抑制剂H154处理的小鼠，原虫血症水平上升迅速，于感染后第11d才达到峰值，峰值为39.47％，随后原虫血症水平下降，至感染后第19d部分小鼠自愈，小鼠生存率为33.33％。　　 5、TLR9抑制剂对P.y17XL感染免疫过程中相关免疫细胞的影响　　 与感染前相比，P.y17XL感染后第3d和5d，正常感染组小鼠脾脏表达TLR9的DCs细胞、DCs亚群、CD4+CD69+T细胞及Tregs均明显升高。感染后第3d，TLR9抑制剂处理组小鼠脾脏表达TLR9的CD11c+DCs及CD4+CD69+Tcells百分比显著低于正常感染及对照组。感染后第3d和5d，TLR9抑制剂处理组小鼠脾脏DCs亚群的百分比显著低于正常感染及对照组。感染后第5d，TLR9抑制剂处理组小鼠脾脏Tregs的百分比显著低于正常感染及对照组。　　 6、TLR9抑制剂对P.y17XL感染免疫过程中相关免疫分子的影响　　 与感染前相比P.y17XL感染后第3d，正常感染组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-10分泌量均显著升高，TLR9抑制剂H154处理组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ分泌量显著低于其他两组，IL-10分泌量显著高于其他两组。　　 结论：　　 1、DCs表达的TLR4/9关键介导P.y17XL易感和抵抗小鼠的感染进程和最终结局。　　 2、DCs通过TLR4/9的表达强化P．y17XL感染早期Th1保护性免疫的建立。