论文部分内容阅读
三维立体细胞培养结合HPLC在线筛选中药活性成分,是近年来发展起来的一种非常重要的药物筛选模型。复合细胞培养支架的制备在生物医药材料领域,已经引起了广泛的关注,复合支架能够整合不同组分的优点而克服各自的缺陷。壳聚糖、纳米羟基磷灰石和丝素蛋白由于具有良好的生物相容性,广泛地被用作细胞支架制备的原材料。但单一组分支架均由于材料自身的一些缺陷,阻碍了它们的应用和发展。壳聚糖的降解过程不易控制,机械性能欠佳；纳米羟基磷灰石虽具有较好的机械强度,但降解速度过于缓慢；丝素蛋白也具有高的机械强度,但易于降解。若将几种材料基质复合,制备复合支架,有望克服单一材料的缺陷,获得既具有良好的生物相容性和机械强度,又具有合理的可降解特性的理想支架。该研究的主要目的就是制备一种新型的三组分复合多孔细胞支架,通过与二组分支架的对比比较,考察了三组分支架的体内体外生物特性。同时将制备的三组分支架用于培养MG-63人骨肉瘤细胞,筛选山茱萸中与细胞作用的几种活性成分。本论文研究内容主要包括以下三个方面：1.壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石支架的制备与表征以冷冻干燥结合溶剂浇注-粒子沥滤技术,采用粒径大小固定的NaCl微球为致孔剂,将含有壳聚糖(CS),丝素蛋白(SF),纳米羟基磷灰(nHA)的三种材料基质复合制备出三组分多孔支架,将其命名为CS/SF/nHA.在制备过程中,通过致孔剂(氯化钠盐)来控制孔的大小和结构,从而获得孔径结构可调的复合多孔支架。为了评价考察CS/SF/nHA三组分细胞支架的一些特性,同时又制备了三种二组分的细胞支架,分别为CS/nHA、CS/SF、nHA/SF作为对照实验组。试验考察了复合支架的微观形貌与孔径之间的关系,并对支架的孔隙率做了简单的评价。动态粘弹谱仪(DMA)对支架的力学性能进行了考察评价,同时模拟体内微环境探究了支架的降解特性,通过以上实验技术为了说明材料的组成成分对支架性能的影响。此外还考察了支架与MG-63人骨肉瘤细胞之间的生物相容性,用MTT法测试细胞在支架上的增殖情况,同时辅助荧光染色分析,进一步说明该支架的良好生物相容性。最终考察了MCF-7人乳腺癌细胞在三维立体支架(CS/SF/nHA)培养模式下筛选山茱萸中与细胞作用的一些活性成分。2.壳聚糖／丝素蛋白／羟基磷灰石支架与二组分支架的性能比较分析通过与二组分对比分析得出：三组分支架CS/SF/nHA具有良好的通透性和微观孔结构,孔径均一,尺寸在100-300um之间,致孔剂密堆积排列,且与二组分支架在微观形貌上没有差异性。此外CS/nHA、CS/SF、nHA/SF、CS/nHA/SF多孔支架的孔隙率均能达到90%以上,且支架的降解过程能够满足生物医药材料的基本要求；机械强度测试结果表明三组分支架明显优于二组分支架；通过与MG-63细胞之间的生物相容性试验表明,细胞在支架上能够粘附与增殖,然而三组分支架CS/nHA/SF更有利于促进细胞的粘附与增殖。将三组分支架CS/SF/nHA作为细胞支架,培养MCF-7人乳腺癌细胞,结合高效液色谱分析,筛选中药山茱萸中与细胞作用的几种活性成分,通过色谱峰面积的变化,计算得到三种水溶性成分：山茱萸苷、獐牙菜苷和马钱素与细胞作用过程的结合度大小,从而为三维立体细胞培养药物筛选奠定一定的实验基础。