几丁质是由N-乙酰葡萄糖胺残基通过β-1,4糖苷键连接而成的直连多糖高聚物,主要存在于昆虫的外骨骼、围食膜、肠道和气管以及植物和真菌的细胞壁中,是自然界中仅次于纤维素的第二大生物多聚物。昆虫几丁质降解酶主要分为糖苷水解酶18家族的几丁质酶(Chitinase,Cht)和糖苷水解酶20家族的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-Acetylglucosaminidase,NAG)两种,这两种酶通过协同作用可将几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。几丁质酶是一种内切酶,可降解几丁质为几丁寡糖,而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是一种外切酶,可将几丁寡糖从非还原端水解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。几丁质降解酶广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液以及一些昆虫的毒腺中,对昆虫生长发育过程中几丁质的代谢起着重要的调控作用。几丁质酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作为潜在的杀虫剂靶标、几丁质生物垃圾的降解和生产N-乙酰氨基葡萄糖的酶工具而受到广泛的关注。本研究主要是将飞蝗Ⅰ型几丁质酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LmNAG1)通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在SF9细胞中进行异质性表达,测定温度和pH对酶活性的影响,以及酶的动力学参数。并通过胶状几丁质结合实验比较LmCht5-1和LmCht5-2对胶状几丁质的结合能力,从而确定几丁质结合结构域(CBD)的功能。主要研究内容分为以下三个部分:一、飞蝗LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达及纯化将飞蝗Ⅰ型几丁质酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LmNAG1)通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在SF9细胞中进行异质性表达。设计带有酶切位点、起始密码子、终止密码子以及6×His标签的PCR引物扩增目的片段,构建到pFastbacTM Dual真核表达载体上,之后将重组载体转化到DH10感受态细胞中,得到重组Bacmid杆粒,将重组Bacmid杆粒转染SF9细胞进行真核表达。利用6×His标签蛋白与Ni-NTA柱的亲和性对所表达蛋白进行纯化。通过SDS-PAGE胶和Western Blot对纯化后的目的蛋白进行检测。二、飞蝗几丁质降解酶的酶学特性分析获得纯化蛋白后,测定了酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、热稳定性以及酶的动力学参数等。结果显示LmCht5-1和LmCht5-2具有相似的最适pH和温度(使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3时,二者的最适pH值为6,使用多聚底物CM-Chitin-RBV时二者的最适pH值均为9,最适温度为40℃)。使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3测定酶的动力学参数时,LmCht5-1的Km值比LmCht5-2小,LmCht5-1的Kcat/Km值比LmCht5-2大,相反,使用多聚底物CM-Chitin-RBV测定酶的动力学参数时,LmCht5-1的Km值比LmCht5-2大,LmCht5-1的Vmax/Km值比LmCht5-2小,说明LmCht5-1倾向于水解寡聚底物,而LmCht5-2则倾向于水解多聚底物。使用4MU-GlcNAc为底物测定LmNAG1的动力学参数时,LmNAG1的Km值为0.28±0.02mM,kcat/Km值为3215.12±61.98 mM-1S-1,说明LmNAG1酶对底物4MU-GlcNAc有着很高的亲和性,且具有很高的催化效率。所以我们得出结论:在蝗虫体内,LmCht5-1可能主要负责降解寡聚几丁质,LmCht5-2可能主要负责降解多聚几丁质,而LmNAG1主要负责将LmCht5-1和LmCht5-2的降解产物通过外切水解作用降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。三、LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性分析LmCht5-1和LmCht5-2在结构上都具有信号肽、一个催化域和一个连接区,此外LmCht5-1比LmCht5-2多一个CBD区(Chitin binding domain)。本研究通过Arakane等[1]所描述的几丁质结合特性研究方法对飞蝗几丁质酶LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性进行了研究,得出结论:含有CBD区的LmCht5-1可以和胶状几丁质紧密结合,而不含CBD区的LmCht5-2则几乎不能结合胶状几丁质。本研究首次将飞蝗Ⅰ型几丁质酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和β-N-乙酰葡萄糖苷酶(LmNAG1)构建于真核表达载体上进行表达和纯化,并对纯化蛋白进行了最适pH、pH稳定性、最适温度、热稳定性以及酶反应动力学参数的测定。进一步明确了LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1的理化特性,为利用几丁质降解酶进行害虫防治提供了理论依据。