背景和目的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位居世界范围及我国恶性肿瘤的第1位,造成严重的医疗卫生负担;靶向治疗为驱动基因阳性不可手术NSCLC的主要系统治疗手段,放射治疗在提高局部控制率、延长患者总生存期和无病生存期方面发挥着重要作用。然而不同表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变状态的局部晚期或转移性NSCLC的最佳联合治疗策略尚不明确,放疗联合EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)与单独EGFR-TKI比较的临床获益尚存争议。以上问题目前均尚未发现系统性的研究报告。因此,本研究第一部分通过循证医学研究方法,全面检索世界范围内关于EGFR-TKI联合胸部放疗(Thoracic Radiotherapy,TRT)治疗NSCLC的临床研究,提取数据后进行Meta分析,明确EGFR-TKI联合胸部放疗治疗NSCLC的有效性和安全性。第二部分采用回顾性队列研究方法,比较真实世界中单独应用埃克替尼与埃克替尼联合胸部病灶放疗治疗的III/IV期或术后复发转移的EGFR突变阳性的NSCLC的临床疗效差异。论文第三部分针对EGFR-TKI应用中不可避免出现获得性耐药的临床问题,通过体外细胞实验,探索不同剂量碳离子束和X射线辐照两种EGFR突变细胞株PC-9(19 DEL)和H1975(21外显子L858R和20外显子T790M双突变)的辐射生物学差异,为不同LET射线在不同EGFR突变状态NSCLC中的应用及利用多线束克服EGFR-TKI耐药提供基础理论依据。通过本系列研究的开展,以期为不可手术NSCLC的综合治疗提供较为全面的研究证据。方法(1)循证医学研究:采用计算机数据库检索的方式,分别检索外文数据库:MEDLINE、EMBASE和Cochrane Library数据库(CENTRIAL),中文数据库:中国期刊全文数据库(CNKI)和中国生物医学文献数据库(CBM),全面收集中英文发表的关于EGFR-TKI联合TRT或化放疗(Chemo-radiotherapy,CRT)治疗局部晚期或晚期NSCLC的相关文献,采用Meta分析的方法进行数据合并,对该类患者的疾病缓解率(Response rate,RR)、总生存期(Overall survival,OS)、无进展生存期(Progression-free survival,PFS)和安全性结局进行全面评价,为EGFR-TKI联合胸部放疗这种治疗模式提供循证医学证据。(2)回顾性队列研究:按照纳入/排除标准,筛选自2012年1月至2017年12月在甘肃省肿瘤医院首次采用埃克替尼联合TRT或单独埃克替尼治疗的EGFR突变阳性的III/IV期或术后复发转移的NSCLC患者,采用倾向评分匹配法对两组患者基线资料进行均衡匹配后,比较两种治疗模式在胸部原发灶RR、PFS、OS、埃克替尼耐药时间及毒副反应发生方面的差异,并分析各临床因素对患者生存情况的影响,统计学分析采用SPSS 17.0软件进行处理,独立样本t检验比较两组患者的一般特征,卡方检验比较两组患者疾病缓解率、毒副反应发生率、复发转移模式的差异,Kaplan-Meier法和log-rank检验估计两组PFS和OS方面的差异,COX多因素回归分析和Pearson相关分析法分析OS的影响因素,p<0.05为差异有统计学意义。(3)体外细胞实验:体外培养两种EGFR突变细胞株PC-9和H1975,选取对数生长期的细胞进行实验,利用等同剂量的碳离子束和X射线进行辐照后,克隆形成实验计算细胞生存分数(Survival fraction,SF)、拟合细胞存活曲线,观察放射敏感性;流式细胞术检测细胞周期;Hoechst染色检测细胞凋亡;RT-PCR法提取乏氧诱导因子-1a(Hypoxic induction factor-1a,HIF-1α)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA,蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)实验检测VEGF和HIF-1α蛋白的表达。获得数据采用SPSS17.0和GraphPad Prism 5软件对结果进行统计分析并绘图,SF比较采用t检验;细胞周期阻滞、凋亡率及HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白表达均采用单因素方差分析进行组间比较,检验水准a=0.05。结果(1)循证医学研究中,共有16项前瞻性单臂研究和14项回顾性临床对照研究被纳入进行Meta分析。12项单臂研究(包括446例患者)报告了TRT联合EGFR-TKI治疗EGFR基因状态未知的NSCLC的RR和生存结果,其中CR、PR、SD和PD分别为0.06(95%CI 0.03-0.09)、0.44(95%CI 0.38-0.49)、0.29(95%CI 0.24-0.34)和0.15(95%CI 0.11-0.19),1年和2年OS分别为0.52(95%CI0.44-0.60)和0.26(95%CI 0.18-0.33)。4项单臂研究(182例患者)报告了CRT联合EGFR-TKI治疗EGFR基因状态未知NSCLC的RR和生存结果,其中CR、PR、SD和PD分别为0.12(95%CI 0.02-0.22)、0.41(95%CI 0.27-0.55)、0.31(95%CI 0.16-0.46)和0.14(95%CI 0.01-0.30,),1年和2年OS分别为0.83(95%CI0.71-0.94)和0.67(95%CI 0.54-0.81)。TRT或CRT联合EGFR-TKI均未发生严重不良事件(Adverse events,AEs)。7项临床对照研究(包括695例患者)报道了TRT+TKI vs.单药TKI治疗EGFR突变型NSCLC的结果,Meta分析结果显示,疾病客观缓解率(Objective response rate,ORR)和疾病控制率(Disease control rate,DCR)的相对危险度(Relative risk,RR)(95%CI)和p值分别为[1.69(1.44-1.98),p<0.00001]和[1.35(1.25–1.46,p<0.00001],两组之间差异存在统计学意义,TRT+TKI组优于单独TKI组;生存率方面,1年和2年OS合并效应量的RR(95%CI)和p值分别为[1.22(1.06-1.41),p=0.007]和[1.56(1.09-2.23),p=0.02],两组之间差异存在统计学意义,TRT+TKI组优于单独TKI组;安全性方面,间质性肺炎、放射性食管炎、恶心呕吐、白细胞减少、肝功异常方面两组间差异也存在统计学意义,TRT+TKI组均高于单独TKI组。7项研究(包括493例患者)报道了TRT+TKI vs.TRT的结果,Meta分析结果显示ORR和DCR的RR(95%CI)和p值分别为[1.40(1.22-1.61),p<0.00001]和[1.13(1.05-1.21,p=0.0007],生存率方面,1年和2年OS的RR(95%CI)和p值分别为[1.42(1.16-1.74),p=0.0006]和[1.71(1.15-2.54),p=0.008],两组之间差异均存在统计学意义,TRT+TKI组优于单独TRT组;安全性方面,皮疹和腹泻方面两组间差异存在统计学意义,TRT+TKI组均高于单独TRT组。(2)回顾性队列研究中,按照纳入/排除标准,经倾向评分匹配后,共纳入56例EGFR突变阳性NSCLC患者,其中埃克替尼+TRT组28例,单独埃克替尼组28例。两组比较,近期疗效方面差异有统计学意义,特别是ORR方面埃克替尼+TRT组显著优于单独埃克替尼组(p=0.019);生存情况方面,1、2年PFS和1年OS方面两组差异无统计学意义(p>0.05),2年OS两组差异存在统计学意义,p值为0.032,中位OS为40.8月vs.25.7月,中位PFS为20.3月vs.13.3月,埃克替尼+TRT组均优于单独埃克替尼组;亚组分析显示,ECOG 2分(HR0.43,95%CI 0.03-0.79)、腺癌(HR 0.44,95%CI 0.02-0.81)、EGFR 19 DEL突变(HR 0.43,95%CI 0.08-0.93)和入组前进行化疗(HR 0.65,95%CI 0.15-0.97)亚组中埃克替尼+TRT组获益更明显;多因素分析显示,埃克替尼耐药时间及总应用时间与PFS和OS均成正相关(p=0.000),患者近期疗效与患者PFS和OS也密切相关(p=0.000)。毒副反应方面,急性放射性肺炎、放射性食管炎、白细胞减少、恶心呕吐两组间差异存在统计学意义(p<0.05),埃克替尼+TRT组高于单独埃克替尼组;而埃克替尼药物相关的皮疹、腹泻、口腔溃疡、肝功能异常、血栓形成、贫血和血小板减少方面两组差异均无统计学意义(p>0.05)。(3)体外细胞实验中,碳离子照射对两种细胞存活抑制较X射线均明显,存活分数明显下降;同等剂量下,碳离子束照射对PC-9细胞存活分数的影响更大,剂量越大,与H1975细胞的差值就越大;但在X射线照射组,两种细胞在不同剂量下存活分数较为相似,说明两种细胞对X射线的辐射敏感性较为一致;细胞存活曲线拟合的碳离子相对于X射线对PC-9和H1975细胞的RBE值分别为2.86和1.85。细胞辐照后24h检测凋亡率,碳离子较X射线辐照所致两种细胞的凋亡更加显著,且随着辐照剂量增加,这种差异更加显著。PC-9和H1975细胞凋亡率进行比较,无论是1、2、4Gy同等剂量的X射线或碳离子辐照,PC-9细胞均显示出较H1975细胞更高的凋亡率,特别是PC-9细胞经碳离子辐照后其凋亡率最高,说明碳离子辐照会导致PC-9细胞更高的凋亡率,且随剂量的增大,这种差异更加显著。细胞周期阻滞方面,无论是碳离子还是X射线均对PC-9和H1975细胞S期影响不明显,辐照主要改变G1期和G2/M期的再分布,随着辐照剂量的增加,G2/M期细胞比例显著增加,碳离子对PC-9和H1975细胞在1、2、4Gy剂量组与0Gy对照组间差异均存在统计学意义(p<0.05),而X射线仅在2、4Gy单次较大剂量辐照下才显示出G2/M期阻滞效应,两种细胞之间比较在各剂量组中均无明显差异。RT-PCR结果显示,PC-9和H1975细胞中HIF-1αmRNA水平在碳离子和X射线各剂量组中下降均不明显,与0Gy对照组比较差异均无统计学意义(p>0.05);碳离子和X射线在各个剂量组下进行比较,差异也无统计学意义(p>0.05)。碳离子对PC-9和H1975细胞中VEGF mRNA的水平有一定下调作用,在4 Gy剂量组下调结果最为显著,与0Gy对照组比较差异存在统计学意义(p<0.05),特别是对H1975细胞作用更为明显,但X射线却无明显下调作用;两种细胞之间进行比较,碳离子在4Gy剂量组下对H1975细胞中VEGF mRNA水平的下调作用较PC-9细胞更为显著,且二者差异存在统计学意义(p<0.05)。WB检测两种因子蛋白表达水平变化,与0Gy对照组比较,无论碳离子和X射线,HIF-1α蛋白表达水平在两种细胞中各剂量组变化均不明显,统计学分析差异均无统计学意义(p>0.05)。随着照射剂量的增加,两种射线对细胞中VEGF蛋白的表达均有下调作用,碳离子辐照下两种细胞在2、4 Gy剂量组与0Gy对照组比较差异均有统计学意义(p<0.05),X射线辐照下仅在4Gy剂量组与0Gy对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。碳离子辐照下,H1975细胞VEGF蛋白的下降较PC-9细胞更为显著,特别是在2、4 Gy剂量组,二者之间差异均存在统计学意义(p<0.05)。结论(1)当前有限研究证据表明,与其他治疗手段比较,如单独TKI、单独TRT、CRT或最佳方案的化疗,TRT联合EGFR-TKI治疗EGFR突变阳性的局部晚期或转移性NSCLC能显著提高近期疾病缓解率,同时改善生存率,甚至对于EGFR基因突变状态未知的患者,也能获得较好的近期疗效和生存获益,且未增加TKI药物相关的毒副反应发生。(2)埃克替尼联合胸部放疗与单独埃克替尼比较在治疗局部晚期或转移性EGFR突变NSCLC中,提高了肺部原发灶的近期缓解率,改善了总生存期,但增加了放疗相关急性放射性肺炎和放射性食管炎的发生风险,在临床实践中应根据患者具体临床特征个体化选择,并密切关注治疗相关的不良反应。(3)对于不同EGFR突变型NSCLC细胞株,PC-9细胞的辐射敏感性在碳离子及大剂量X射线辐照下较H1975更高;碳离子相对于X射线,具有更高的放射生物学效应,同等剂量下具有显著降低细胞克隆存活率、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、促进G2/M期阻滞等效应,而且碳离子具有显著下调H1975细胞中VEGF水平的作用,提示碳离子可能通过下调肿瘤组织中VEGF水平而逆转EGFR-TKI耐药、改善肿瘤化疗敏感性。