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温和气单胞菌(Aeromonas sobria),又称威隆气单胞菌温和生物型(A.veronii bv.sobria),是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一,能引起鱼类、爬行类、两栖类等冷血动物的出血性败血症,同时,该菌也是重要的人畜共患病的病原菌,能引发腹泻、伤口感染和败血症等症状。研究报道显示,温和气单胞菌广泛存在于水域、土壤及水生动物体内,是一种条件性致病菌,其主要致病因子是温和气单胞菌产生的多种溶血素和肠毒素,这些毒素具有多种生物活性,可引起动物体发生复杂的病理变化。目前尚未见有关于黄颡鱼患温和气单胞菌的报道,本试验对发病后死亡的黄颡鱼体内分离的致病性病原菌进行了生化鉴定和分子生物学鉴定,同时进行生物学特性研究和致病性试验及药敏试验,并对其主要的致病因子溶血素基因进行了克隆和表达。1黄颡鱼分离病原菌的鉴定从患病死亡后的黄颡鱼体内分离并纯化后,获得两株病原菌RC-07-KA和RC-07-XB,通过对病原菌的形态特征、培养特性和生理生化特征等进行试验,并通过弧菌科细菌生化鉴定编码(GY-9V)系统鉴定方法,将分离菌株鉴定为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。通过对基因组16S rRNA基因扩增,扩增出分离菌株16S rRNA基因143lbp的基因片段,序列分析结果表明,分离菌株的16S rRNA基因核苷酸序列与Genbank上报道的温和气单胞菌的16S rRNA基因序列亲缘关系最近,同源性高达97%以上。2温和气单胞菌分离菌株的生物学特性研究本试验用黄颡鱼分离菌株RC-07-KA对鲫鱼和黄颡鱼进行致病性试验,并将分离菌株在不同的pH值和温度条件下进行培养,以筛选出分离菌株生长的最适pH值和温度。用20种抗生素和6种常用的消毒剂对分离菌株进行了药物敏感性测定。结果显示:温和气单胞菌分离菌株对鲫鱼和黄颡鱼都有较强的致病力,对鲫鱼的最小致死量为1.7×10~7CFU,对黄颡鱼的最小致死量为1.95×10~6CFU,分离菌株生长的最适pH范围在7.0～7.5之间,其最适生长温度在30℃左右。药物敏感试验表明丁胺卡拉霉素、丙氟哌酸、氧哌嗪青霉素、先锋霉素、卡拉霉素、复方新诺明、庆大霉素等药物抑菌效果最佳;几种消毒剂对该菌都有明显的抑菌作用,尤其是甲醛、戊二醛和癸甲溴铵等对该菌具有较强的杀灭效果。3温和气单胞菌分离菌株溶血素基因片段的克隆与表达根据GeneBank公布的人源性温和气单胞菌的溶血素(hly)基因序列,设计含BamHⅠ和HindⅢ位点的引物,以黄颡鱼分离菌株的基因组DNA为模板,经PCR扩增后,将hly,基因片段克隆到pMD19-T载体上,构建得到重组质粒pMT-hly,并比较扩增的溶血素基因序列的同源性,然后将该基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,构建原核重组表达质粒pMT-GEX-hly,转化BL21并进行SDS-PAGE分析。结果显示:PCR扩增出分离菌株溶血素基因一条长度为830bp的结构基因片段,克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性达98%;重组菌株经IPTG诱导后,表达出约57KD的hly基因融合蛋白。本试验用人源温和气单胞菌溶血素基因设计的引物可以扩增出黄颡鱼温和气单胞菌分离菌株的溶血素基因片段,其基因蛋白还可以得到高效表达,表明人源性温和气单胞菌和鱼源性温和气单胞菌具有较高的同源性。