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伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种可感染猪、牛、羊等家畜,犬猫等宠物,家兔、狐、貉、水貂等毛皮动物和野生动物,以引起发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎等主要临床症状的疱疹病毒。该病毒可感染各年龄段的猪群,主要造成种猪繁殖障碍、仔猪发生神经系统和呼吸道症状。自2011年PRV变异株出现以来,导致Bartha-K61等传统疫苗的保护力有所降低,我国多个地区已免疫PRV疫苗的猪场发生伪狂犬病疫情,严重威胁了我国生猪养殖业的健康可持续发展。因此,本研究开展了PRV变异株的病原学、快速鉴别诊断技术、新型基因工程疫苗、转录组和蛋白质组学的研究,为该病有效防控奠定技术和理论基础。取得的主要研究成果有:1.本研究对山东某Bartha-K61疫苗免疫猪场感染的PRV野毒株进行了分离鉴定,成功分离鉴定到PRV SD-2017株,并完成了生物学特性分析。基于g E、TK和g B等毒力基因的遗传进化分析,确定该毒株为我国当前流行的PRV变异毒株。透射电镜观察病毒粒子直径大约在140～180 nm,有厚囊膜,囊膜表面有放射状纤突,粒子核心致密,呈现出疱疹病毒典型的病毒粒子形态结构。该毒株在PK-15细胞上的病毒滴度可达到109.0TCID50/m L,对家兔的半数致死量(LD50)为3.2×102.0TCID50/m L。2.针对PRV疫苗株与野毒株的鉴别诊断,筛选到特异性引物和探针,成功建立了PRV g B和g E基因的酶促重组等温扩增（ERA）荧光检测方法。g B和g E基因的ERA检测方法的敏感性分别为10copies/μL、103copies/μL,与荧光定量PCR方法比对,g B和g E基因检测结果符合率分别为100%和92.31%。该方法在38℃恒温反应25 min,能够实现对PRV g B和g E基因的特异性鉴别检测,将反应体系进行预冻干后,可组装成检测试剂盒进行现场应用,可有效应用于PRV野毒和疫苗毒的临床快速诊断。3.以PRV变异毒株SD-2017株作为亲本毒株,利用同源重组技术对g E/g I/TK毒力基因进行了缺失,分别构建了PRV SD-2017Δg E/g I株和SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株,并分析了其一步生长曲线、致病性等生物学特性,基因缺失株的病毒含量在PK-15细胞上仍能达到108.0TCID50/m L,SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株对家兔的LD50>1.0×106.0TCID50/m L,为针对PRV变异株开发基因缺失灭活疫苗和减毒活疫苗提供了理想的候选疫苗种毒。4.将树突状细胞靶向诱导肽DCpep作为分子内佐剂,脑膜炎奈瑟氏球菌Por B蛋白作为疫苗佐剂,分别构建了含有蛋白分泌信号肽gp67的重组杆状病毒Ac-g B-DCpep和Ac-Por B,利用昆虫细胞真核表达系统进行了PRV g B-DCpep蛋白融合表达和Por B蛋白真核表达,基于前期研究构建的PRV毒力基因缺失株,分别制备了PRV SD2017株Δg E/g I/TK三基因缺失活疫苗和Δg E/g I双基因缺失灭活疫苗,与g B-DCpep基因工程亚单位疫苗、Bartha K61活疫苗一同在家兔上进行了对PRV变异株感染的免疫保护效果评价。构建的SD2017Δg E/g I/TK减毒活疫苗、PRV-g B+Por B亚单位疫苗和SD2017Δg E/g I+Por B灭活疫苗,在家兔上显示了对变异株SD-2017良好的免疫保护作用。结果说明DCpep可作为潜在的分子佐剂,Por B蛋白可以作为新型疫苗佐剂,对体液免疫和细胞免疫均具有显著的诱导刺激作用,后续可应用于新型基因工程疫苗的制备,为PRV新型疫苗开发提供了新的策略。5.基于Illumina转录组测序技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的转录组差异进行了全面分析,发现差异上调的基因多集中在细胞周期、m TOR信号通路、自噬-动物、PI3K-Akt信号通路、细胞衰老、癌症的途径、胞吞作用、HTLV-I感染、ap1信号通路、MAPK等信号通路。差异下调的基因多集中在有氧化磷酸化、RNA转运、碳代谢、HTLV-I感染、人乳头瘤病毒感染和MAPK等信号通路。差异表达下调的基因富集最多的通路是核糖体、氧化磷酸化RNA转运、m RNA监测途径、卵母细胞减数分裂、内质网中的蛋白质加工、丙酸酯代谢、基因复制、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、生热等信号通路。相关基因的其生物学意义需要进一步研究揭示。6.利用TMT标记定量蛋白质组学技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的蛋白质组学差异进行了全面分析,解析了差异蛋白参与不同毒力PRV感染细胞中的生物学过程、分子功能及细胞定位。差异蛋白涉及的主要信号通路有抗原处理和展示、初级胆汁酸合成、醚脂质代谢、矿物质吸收、过氧化物酶体、HTLV-I感染、催产素信号通路、单纯疱疹感染、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞衰老、趋化因子信号通路、Notch信号通路等。PRV病毒-宿主细胞相互作用的机制值得进一步研究,尤其是蛋白质组差异中涉及的关键基因如何调节PRV感染方面,将有助于更好地了解PRV的特定感染机制。另外,本研究通过PRV感染PK15细胞的转录组和蛋白质组GO功能富集关联性分析发现,两者在细胞部分、细胞、细胞器部分大分子复合物、催化活性、结合、细胞过程、代谢过程等方面的显著差异相关联,为后续深入研究不同PRV毒株的致病机理提供了有利条件。