宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,已成为危害女性身体健康的最主要的杀手。世界卫生组织统计资料表明,宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二,在一些发展中国家甚至位居首位,每年全球大约有50万例新发宫颈癌病例,约20万人死于宫颈癌。据不完全统计,我国现有宫颈癌病人约13.8万,每年约有5万人死于宫颈癌。大量研究资料证明,约80%的宫颈癌与4种高危型(16、18、31型和45型)的HPV感染相关,其中约50%的宫颈癌与HPV16感染相关,根据分子流行病学资料的结果,HPV16是导致我国妇女宫颈癌的主要型别。但是,目前临床上尚无预防HPV16感染的措施,对中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果也不理想。宫颈癌的复发率较高且治疗费用也高。因此,研制高效、安全和廉价的HPV DNA疫苗,采用特异性的免疫接种方式预防和治疗HPV感染及其所引起的恶性病变,具有重要的现实意义。 大料文献资料证实,人乳头瘤病毒16型E7基因是重要的转化基因,在宫颈癌细胞中持续表达。大多数研究中靶基因主要集中于E7基因,然而由于E7基因本身具有转化活性,直接应用于人体有一定的危险性,去除E7的转化活性基团,保留其抗原性成为基因疫苗研制的前提。E7蛋白C末端锌指结构“Cys-X-X-Cys”对其稳定性有重要作用,锌指结构的突变可显著降低E7蛋白的稳定性和致癌性,提高DNA疫苗的安全性;改变E7C-末端锌指结构中的任何一个Cys(C58G、C61G、C91G、C94G),均能使E7蛋白完全失去永生化人上皮细胞的能力。 尽管DNA疫苗有很多优点,但是裸DNA疫苗并不能诱导强烈的、足以保护动物抵抗HPV感染的、高水平的免疫应答,因此必须想方设法增强其免疫原性。近年来研究资料表明,热休克蛋白(heat shock protein,HSP)与抗原基因融合具有增强DNA疫苗免疫效应的潜能,HSP抗原肽复合物(来源于肿瘤或病毒感染细胞)能诱导较好的抗肿瘤和感染免疫应答。HSP介导的抗原呈递具有“cross-presentation”现象,即通过HSP介导进入体内的外源蛋白,可以诱导出抗原特异性的CTL。 基于以上原理,我们将突变(91位点C→G)锌指结构的E7基因、野生型E7基因、热休克蛋白70基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1~-质粒中,构建了pcd-mE7(突变)、pcd-wE7(野生)、pcd-HSP70三种重组质粒,经酶切和PCR鉴定构建成功。与嵌合型 pcd-HPVmE7-HSP70 DNA 疫苗作比较,进一步研究嵌合型pcd-HPVmE7-HSP70DNA疫苗的免疫增强效应。我们用这四种重组质粒、空载体及PBS