论文部分内容阅读
乳腺癌(breast cancer)严重威胁女性的健康与生命。乳腺癌转移至骨、脑、肺等器官增加了乳腺癌的治疗难度,也降低了患者的生存质量。乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastases,BCBM)患者的中位生存时间短,确诊BCBM后一年内死亡率约为80%,即使很小的损伤也可能会导致神经功能病变,影响生活质量。研究乳腺癌脑转移的机制、寻找乳腺癌细胞膜表面与脑转移有关的靶蛋白,对乳腺癌脑转移的早期诊断及治疗具有重要意义。本实验室前期通过噬菌体展示肽库筛选技术(Phage display technology)进行全细胞消减筛选,获得能与人乳腺癌专一性脑转移细胞系231-BR结合的多肽,命名为BRBP1(专利号:ZL201210538671.4),体内体外实验均证明该肽与231-BR细胞呈特异性结合;临床乳腺癌病理切片结果也显示BRBP1肽与人乳腺浸润性导管癌组织标本特异性结合且倾向结合高转移潜能的肿瘤细胞。因此,寻找与BRBP1肽结合的靶蛋白,对探索乳腺癌脑转移的作用机制,深度认识及拓宽BRBP1肽的应用价值有重要意义。本实验室前期真核表达BRBP1-Fc肽体,将BRBP1-Fc肽体与Protein G磁珠结合后,经免疫共沉淀技术获得231-BR细胞总蛋白中能与肽体相结合的蛋白;同时将BRBP1-BIOTIN与链霉亲和素磁珠相互作用,经免疫沉淀技术获得231-BR细胞膜蛋白中能与生物素肽(BRBP1-BIOTIN)相结合的蛋白。设立对照组,将两种方法获得的蛋白通过银染获得差异性条带,再通过串联质谱序列分析,BRBP1-Fc肽体与231-BR细胞总蛋白的免疫共沉淀获得14个候选蛋白分子,BRBP1-BIOTIN与231-BR细胞膜蛋白的免疫沉淀获得10个候选蛋白分子,本研究进一步深入分析与鉴定这些候选蛋白是否与BRBP1特异性结合。目的:检测可疑靶蛋白MVP、ERLIN2、RDX、AP2B1和SND1在人乳腺癌细胞系231-BR、MDA-MB-231和MCF-7中的表达,鉴定以上可疑靶蛋白能否与BRBP1肽相互作用。方法:(1)通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MVP、ERLIN2、RDX、AP2B1和SND1的mRNA在人乳腺癌细胞系231-BR、MDA-MB-231和MCF-7中的表达。(2)通过western blot、细胞免疫荧光及流式细胞术检测MVP、ERLIN2、RDX和AP2B1蛋白在人乳腺癌细胞系231-BR、MDA-MB-231和MCF-7中的表达。(3)针对MVP、ERLIN2、AP2B1和SND1设计siRNA序列,将siRNA分别转染至231-BR细胞中干扰蛋白的表达。(4)通过western blot验证siRNA对靶蛋白的干扰效率,经流式细胞术验证分别干扰了MVP、ERLIN2、AP2B1和SND1表达的231-BR细胞与BRBP1肽的结合情况。结果:(1)MVP的mRNA和蛋白均在231-BR细胞高表达,在MDA-MB-231细胞低表达,在MCF-7细胞不表达;转染siRNA干扰MVP的表达后,BRBP1荧光肽与231-BR细胞的结合率升高。(2)ERLIN2的mRNA在231-BR细胞高表达,在MDA-MB-231和MCF-7细胞低表达,ERLIN2的蛋白在231-BR细胞膜蛋白中有表达,在MDA-MB-231和MCF-7细胞膜蛋白中几乎不表达;干扰ERLIN2的表达后BRBP1荧光肽与231-BR细胞的结合并无明显改变。(3)RDX的mRNA在231-BR细胞高表达,但western blot、细胞免疫荧光及流式细胞术结果均显示其在MCF-7细胞的表达高于在231-BR和MDA-MB-231细胞的表达。(4)AP2B1的mRNA在231-BR细胞高表达,在MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞低表达,其蛋白水平在三种细胞中并无明显差异;但经PDB数据库和Pepsite 2平台分析BRBP1肽与AP2B1的结合程度,显示AP2B1存在1个能与BRBP1结合的结构域,干扰AP2B1的表达后BRBP1荧光肽与231-BR细胞的结合并无明显改变。(5)SND1的mRNA在231-BR、MDA-MB-231和MCF-7细胞中的表达不存在显著差异,但经PDB数据库和Pepsite 2平台分析BRBP1肽与SND1的结合程度,显示SND1存在6个能与BRBP1结合的结构域;干扰SND1的表达后BRBP1荧光肽与231-BR细胞的结合略有降低。结论:干扰ERLIN2和AP2B1的表达后,BRBP1肽与231-BR细胞的结合并没有发生改变,RDX在231-BR细胞表面的表达与BRBP1靶蛋白的表达情况不符,因此ERLIN2、AP2B1和RDX并不是能与BRBP1肽相结合的靶蛋白;干扰MVP的表达后,BRBP1肽与231-BR细胞的结合不降反升,MVP蛋白可能与BRBP1肽存在某种联系,需进一步验证;干扰SND1的表达后,BRBP1肽与231-BR细胞的结合略有下降,SND1与BRBP1肽的关系需进一步确认。