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三叶木通(Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.)为木通科(Lardizabalaceae)木通属(Akebia Decne.)药用藤本植物,属基部真双子叶植物类群,在被子植物演化史上具有承上启下的重要地位。三叶木通花的形态学研究发现:发育初期是两性花,后期雌花中的雄蕊及雄花中的心皮分别退化,从而形成功能上的单性花,可知三叶木通花的发育模式为Ⅰ型单性花发育途径。但其两性花发育为单性花的分子调控机制尚不清楚。研究表明,性别决定基因、表观遗传修饰和植物激素等是单性花性别分化的影响因素。MADS-box基因家族在调控单性花性别分化过程中占有重要地位。依据花发育“ABCDE”模型,其中的C类基因不仅为决定雄蕊和心皮发育的器官特征基因,而且很可能是调控植物性别分化的关键因素。A类基因不仅是决定萼片和花瓣发育的器官特征基因,并且对于模式生物拟南芥的研究发现,A类基因与C类基因在功能上具有相互拮抗的关系。因此为了研究三叶木通两性花发育为单性花的分子调控机制,探究三叶木通花发育A类和C类基因的关系,有必要对三叶木通A类及C类基因的功能进行研究。本研究为了了解三叶木通中A类和C类基因及其编码蛋白的作用模式,对A类基因中的AktFL1基因及C类基因中的AktAG1基因进行了研究。通过半定量RT-PCR技术初步分析了二者的表达方式,运用拟南芥异位转化技术分别研究了二者对拟南芥花发育的影响,同时利用亚细胞定位技术、双分子荧光互补技术探究了这两个基因编码的蛋白在细胞中的表达位置及相互作用方式。研究结果初步揭示了AktFL1和AktAG1基因的功能,对进一步探究三叶木通两性花转变为单性花的分子机制具有重要的意义。本研究的结果和结论如下:1.AktFL1和AktAG1基因的半定量RT-PCR初步分析。本课题组根据三叶木通花的心皮和雄蕊的高度比值变化,将其发育过程划分为4个时期。取三叶木通花发育时期1至时期4的雌、雄花的总RNA作为扩增模板,选取18SrRNA基因为内参,进行半定量RT-PCR。结果显示,AktFL1基因在雌花中表达量先增加后减少,在雄花中表达量先减少再增加。AktAG1基因在雌雄花中均表现出先增加再减少的趋势,且在第2和第3时期,雌花表达量均略高于雄花,在第4时期基本持平。由此得出,AktFL1基因和AktAG1基因在表达上无相互拮抗的现象。2.AktFL 和AktAG1基因在拟南芥植株的过表达研究。构建35S::AktFL1和35S::AktAG 过表达载体转化拟南芥植株,AktAG1转基因植株出现雄蕊增高的现象,推断AktAG1基因能促进雄蕊发育,参与调控三叶木通单性花的形成过程。AktFL1转基因植株出现萼片颜色变浅的现象,猜测AktFL1基因参与调控萼片色泽的形成过程。此外,AktFL1和AktAG1转基因植株都表现出早花现象,且均形成2-3个顶端花,说明AktFL1和AktAG1基因均能促进拟南芥从营养生长向生殖生长的转变。因此未得出AktFL1和AktAG1基因在功能上有相互拮抗作用,尚需进一步求证。3.AktFL1和AktAG1基因编码蛋白的亚细胞定位研究。构建p1302-AktFL1-GFP和p1302-AktAG1-GFP融合表达载体,分别转化烟草细胞和洋葱细胞。结果显示p1302-AktFL1-GFP和p1302-AktAG1-GFP均定位于烟草细胞以及洋葱细胞的细胞质中。表明AktFL1和AktAG1蛋白都不具有核定位能力,可能需要与其它转录因子共同形成复合体输入细胞核内,从而调控三叶木通花器官的发育。4.AktFL1和AktAG1基因编码蛋白间的互作研究。构建瞬时表达载体pYNE-AktFL1、pYNE-AktAG1、pYCE-AktFL1 和 pYCE-AktAG1,转化烟草细胞,观察YFP荧光蛋白的复性情况。实验结果显示AktFL1与AktAG1既能各自形成同源二聚体,也能形成异源二聚体。而且由YFP荧光出现在烟草细胞中的位置可以得出,AktFL1与AktAG1蛋白形成的同源或异源二聚体均定位在烟草细胞质。说明随着被子植物的不断演化,A类蛋白与C类蛋白在不同的植物中,演化出多样的互作模式。本研究通过半定量RT-PCR技术初步探究这两个基因的表达方式,得出AktFL1基因和AktAG1基因在表达上无相互拮抗的现象;进一步运用拟南芥异位转化技术来研究二者对拟南芥花器官发育的调控功能,得出AktAG1基因能促进雄蕊发育,参与调控三叶木通单性花的形成过程,尚未得出AktFL1和AktAG1基因在功能上有相互拮抗作用,仍需进一步求证;利用亚细胞定位技术得出这两个基因编码蛋白均定位于细胞质中;利用双分子荧光互补技术得出这两个基因编码蛋白既能各自形成同源二聚体,也能形成异源二聚体,形成的同源或异源二聚体均定位在烟草细胞质。这些研究结果将为探究三叶木通由两性花形成单性花的分子机制提供理论依据,为建立三叶木通花发育基因调控网络奠定基础。