猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种急性传染病,可引起猪只急性腹泻并迅速脱水、死亡,对哺乳仔猪危害最大。近年来,PED在世界各地频繁爆发。众多研究表明,PEDV变异是导致疫情加剧的主要原因。因此对变异毒株开展组织培养特性、病理学特性、分子生物学特性的系统研究具有重要意义。本研究以采自四川峨眉某猪场疑似PEDV感染仔猪的小肠及内容物作病料,经RT-PCR检测,选择PEDV阳性病料按常规方法处理后接种Vero细胞进行病毒分离,并在细胞维持液中按5 μg/mL量加入胰酶,盲传至出现典型细胞病变。结果在第5代开始出现细胞病变(CPE),传至第25代可在接毒后20 h稳定出现典型CPE,表现为细胞变圆和变亮、颗粒物变多、细胞融合、细胞脱落、死亡并形成拉网状,对分离毒进行挑斑纯化。经RT-PCR检测和S基因测序证实本研究成功分离了PEDV毒株,将其命名为EM-P株。经测定病毒的TCID50为1×10-6·5/mL将分离株EM-P口服接种1周龄哺乳仔猪,成功建立PED病理模型。相应组织器官病理组织学观察显示,PEDV EM-P株所致感染呈持续性、多脏器性,且主要损伤肠道、肠系膜淋巴结、肺、脾。剖检病理变化表现为肠壁变薄、充血,肠上皮细胞脱落；肠系膜淋巴充血,淋巴细胞减少、细胞空泡变性：肺边缘贫血,局部淤血、水肿,肺泡融合：脾边缘变薄呈半透明状,白髓萎缩等。利用PEDV N基因和内参基因GAPDH基因建立了qRT-PCR方法,并用该方法对相应组织进行病毒载量检测,结果在肠、肠系膜淋巴结、肺、脾中病毒载量最高,而且感染时间早、持续时间长。以上研究结果表明感染仔猪病理损伤程度与病毒载量呈正相关。参照Genebank已公布的PEDV CV777株全基因序列,设计18对引物,对EM-P株进行全基因分段克隆。EM-P株接种Vero细胞至75%以上细胞出现CPE后,提取总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到18个片段,经克隆、测序及拼接,获得EM-P株全基因组(cDNA)序列。基因组全长28029 bp,经与已报道6个代表毒株进行比对分析,结果显示EM-P株具有典型的PEDV基因组特征,与参考毒株同源性在97.3%-98.2%。以PEDV CV777株为参考对各基因序列进行分析,结果显示EM-P株S1基因、ORF1基因等出现明显变异,推测其可能导致毒株免疫原性和病毒复制能力等生物特性改变。而EM-P株ORF3基因具有完整的开放阅读框,符合强毒株特征。以PEDV CV777株等18个毒株为参考,重点对EM-P株S基因序列进行系统分析并构建遗传进化树,显示EM-P株位于G1-1亚群,但又独立为一个分支,说明EM-P株可归为新流行毒株；EM-P株与CV777株、加拿大、日本、韩国等其它多数国家的流行毒株及2010年以前的中国毒株处于同一亚群,提示该毒株既可能由国外传入也可能是原有流行毒株变异而成。