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目的：
本课题旨在以本课题组前期研究为基础，建立乙醇、HBV双因素诱导的小鼠肝癌癌前病变模型，选用葛花解酲方干预，研究该方对VEGF信号通路及相关因子MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白表达水平及PI3K、Akt磷酸化的活性影响情况，进一步研究肝癌癌前病变的发病机制。
方法：
本实验共用小鼠30只，其中HBV转基因雄性小鼠24只，普通BALB/C雄性小鼠6只，适应性喂养5天，以6只为一组，随机分组，分为.5组：葛花解酲方高剂量组(GH)、葛花解酲方中剂量组(GM)、葛花解酲方低剂量组(GL)，模型组(Control)，正常组(Normal)。本实验用药组的用药量，是按照动物药理实验与方法折算，并参考本课题组前期实验用药量及普通成年人常规用量计算得出，以0.4g、0.8g、1.6g（生药）/10g小鼠体重，在实验前用蒸馏水按0.25mL药液/10g体重给药体积调整水煎剂浓度，为GL、GM、GH组灌胃，等体积蒸馏水给予Control组和Normal组，1次/天;30min后GH、GM、GL组和Control组给予53％(V/V)红星二锅头白酒，剂量为10mL/kg，在清晨、傍晚两次灌胃，每日2次，两次时间间隔＞8h，Normal组给予等体积蒸馏水。在灌胃期间，小鼠可以自由饮水、进食，并且每5天称一次体重以调节每只小鼠的灌胃剂量。实验期间应注意观察小鼠一般状态，包括小鼠的皮毛光泽度，精神状态，饮食及大便情况等。小鼠取材时间确定为造模的第20周末，取材前对小鼠禁食不禁水24小时。采用摘除眼球取血的方式取得小鼠血液并离心获得血清，以颈椎脱臼的方式处死小鼠后，立即取得小鼠肝脏及胸腺并称重，以计算出肝脏指数及胸腺指数，并将小鼠肝脏分为两部分保留，一部分保存于4％多聚甲醛，一部分保留于-80℃冰箱，用于各指标检测;小鼠肝脏损伤情况通过做肝脏组织病理切片观察。反应小鼠肝功能情况的AST、ALT、GST、GGT的活性程度采取比色法检测;检测肝组织中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白的表达水平，以及PI3K、Akt蛋白磷酸化的活性情况采取免疫组织化学法;检测肝组织中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白的表达水平，以及PI3K、Akt蛋白磷酸化的活性情况采取Western blot检测法。检测血清及肝组织中VEGF，肝组织MMP-9、TGF-β1、COX2蛋白表达情况采取ELISA检测法。
结果：
1.乙醇及HBV双因素对小鼠的影响：从小鼠体重来看，与Normal组相比，Control组小鼠体重增长水平显著低于Normal组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Control相比，GH、GM、GL组小鼠体重增长显著高于Control组，差异具有统计学意义(P＜0.05);从小鼠肝重和肝脏指数来看，与Normal组相比，Control组小鼠肝脏重量和肝脏指数显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Control组小鼠相比，GH、GM、GL组肝重和肝脏指数显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05);从小鼠胸腺重和胸腺指数来看，与Normal组相比，Control组胸腺重和胸腺指数显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Control组相比，GH、GM、GL组胸腺重和胸腺指数显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.葛花解酲方对ALT、AST、GST、GGT活性的影响情况：与Control组相比，Normal组和GH、GM、GL组各检测指标具有显著差异，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Normal组相比，Control组血清中ALT、AST、GST、GGT活性显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与Control组相比，GH、GM、GL组血清中ALT、AST、GST、GGT分泌水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.葛花解酲方在不同肝脏微环境对血管新生的影响及其调控VEGF信号转导通路相关因子的影响：与Control组相比，Normal组和GH、GM、GL组中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2，PI3K、Akt及磷酸化表达具有显著差异，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Normal组相比，Control组中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2，PI3K、Akt及磷酸化显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与Control组相比，GH、GM、GL组各指标分泌水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1.乙醇、HBV双因素对小鼠的刺激严重影响小鼠生长情况，体重增长缓慢;小鼠肝重和肝脏指数的增加表明乙醇和HBV两种因素引起的肝损伤严重。胸腺重量和胸腺指数的下降表明两种因素严重影响小鼠的免疫功能。
2.葛花解酲方高中低剂量组肝功能指标中，ALT、AST、GST、GGT活性均下降，说明葛花解酲方可以缓解肝损伤，保护肝脏。
3.葛花解酲方具有抑制肝癌癌前病变小鼠肝脏组织中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白表达作用。
4.葛花解酲方具有抑制肝癌癌前病变小鼠肝脏中PI3K、Akt蛋白磷酸化活性作用。
5.葛花解酲方对肝癌癌前病变小鼠肝功能具有改善作用，可以使得小鼠血清中VEGF表达程度下降。
因此，通过实验结果分析表明，葛花解酲方可以抑制肝脏癌前病变血管生成，而葛花解酲方抑制血管新生的作用机制可能与其下调VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白及PI3K、Akt蛋白磷酸化活性有关，从而减轻肝癌癌前病变的进一步恶化，从而达到保护肝脏和逆转肝癌癌前病变的作用。
本课题旨在以本课题组前期研究为基础，建立乙醇、HBV双因素诱导的小鼠肝癌癌前病变模型，选用葛花解酲方干预，研究该方对VEGF信号通路及相关因子MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白表达水平及PI3K、Akt磷酸化的活性影响情况，进一步研究肝癌癌前病变的发病机制。
方法：
本实验共用小鼠30只，其中HBV转基因雄性小鼠24只，普通BALB/C雄性小鼠6只，适应性喂养5天，以6只为一组，随机分组，分为.5组：葛花解酲方高剂量组(GH)、葛花解酲方中剂量组(GM)、葛花解酲方低剂量组(GL)，模型组(Control)，正常组(Normal)。本实验用药组的用药量，是按照动物药理实验与方法折算，并参考本课题组前期实验用药量及普通成年人常规用量计算得出，以0.4g、0.8g、1.6g（生药）/10g小鼠体重，在实验前用蒸馏水按0.25mL药液/10g体重给药体积调整水煎剂浓度，为GL、GM、GH组灌胃，等体积蒸馏水给予Control组和Normal组，1次/天;30min后GH、GM、GL组和Control组给予53％(V/V)红星二锅头白酒，剂量为10mL/kg，在清晨、傍晚两次灌胃，每日2次，两次时间间隔＞8h，Normal组给予等体积蒸馏水。在灌胃期间，小鼠可以自由饮水、进食，并且每5天称一次体重以调节每只小鼠的灌胃剂量。实验期间应注意观察小鼠一般状态，包括小鼠的皮毛光泽度，精神状态，饮食及大便情况等。小鼠取材时间确定为造模的第20周末，取材前对小鼠禁食不禁水24小时。采用摘除眼球取血的方式取得小鼠血液并离心获得血清，以颈椎脱臼的方式处死小鼠后，立即取得小鼠肝脏及胸腺并称重，以计算出肝脏指数及胸腺指数，并将小鼠肝脏分为两部分保留，一部分保存于4％多聚甲醛，一部分保留于-80℃冰箱，用于各指标检测;小鼠肝脏损伤情况通过做肝脏组织病理切片观察。反应小鼠肝功能情况的AST、ALT、GST、GGT的活性程度采取比色法检测;检测肝组织中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白的表达水平，以及PI3K、Akt蛋白磷酸化的活性情况采取免疫组织化学法;检测肝组织中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白的表达水平，以及PI3K、Akt蛋白磷酸化的活性情况采取Western blot检测法。检测血清及肝组织中VEGF，肝组织MMP-9、TGF-β1、COX2蛋白表达情况采取ELISA检测法。
结果：
1.乙醇及HBV双因素对小鼠的影响：从小鼠体重来看，与Normal组相比，Control组小鼠体重增长水平显著低于Normal组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Control相比，GH、GM、GL组小鼠体重增长显著高于Control组，差异具有统计学意义(P＜0.05);从小鼠肝重和肝脏指数来看，与Normal组相比，Control组小鼠肝脏重量和肝脏指数显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Control组小鼠相比，GH、GM、GL组肝重和肝脏指数显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05);从小鼠胸腺重和胸腺指数来看，与Normal组相比，Control组胸腺重和胸腺指数显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Control组相比，GH、GM、GL组胸腺重和胸腺指数显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2.葛花解酲方对ALT、AST、GST、GGT活性的影响情况：与Control组相比，Normal组和GH、GM、GL组各检测指标具有显著差异，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Normal组相比，Control组血清中ALT、AST、GST、GGT活性显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与Control组相比，GH、GM、GL组血清中ALT、AST、GST、GGT分泌水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
3.葛花解酲方在不同肝脏微环境对血管新生的影响及其调控VEGF信号转导通路相关因子的影响：与Control组相比，Normal组和GH、GM、GL组中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2，PI3K、Akt及磷酸化表达具有显著差异，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与Normal组相比，Control组中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2，PI3K、Akt及磷酸化显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与Control组相比，GH、GM、GL组各指标分泌水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1.乙醇、HBV双因素对小鼠的刺激严重影响小鼠生长情况，体重增长缓慢;小鼠肝重和肝脏指数的增加表明乙醇和HBV两种因素引起的肝损伤严重。胸腺重量和胸腺指数的下降表明两种因素严重影响小鼠的免疫功能。
2.葛花解酲方高中低剂量组肝功能指标中，ALT、AST、GST、GGT活性均下降，说明葛花解酲方可以缓解肝损伤，保护肝脏。
3.葛花解酲方具有抑制肝癌癌前病变小鼠肝脏组织中VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白表达作用。
4.葛花解酲方具有抑制肝癌癌前病变小鼠肝脏中PI3K、Akt蛋白磷酸化活性作用。
5.葛花解酲方对肝癌癌前病变小鼠肝功能具有改善作用，可以使得小鼠血清中VEGF表达程度下降。
因此，通过实验结果分析表明，葛花解酲方可以抑制肝脏癌前病变血管生成，而葛花解酲方抑制血管新生的作用机制可能与其下调VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、Akt蛋白及PI3K、Akt蛋白磷酸化活性有关，从而减轻肝癌癌前病变的进一步恶化，从而达到保护肝脏和逆转肝癌癌前病变的作用。