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目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OSA）是最常见原发性骨组织的恶性肿瘤,每年全世界每百万人约有1至3例发病。它主要发生在儿童和青少年中,第二高发人群是65岁以上的老年人。它是一种在所有儿科癌症中存活率最低的恶性骨肿瘤。目前的治疗包括手术切除和术前、术后联合应用化疗药物（多柔比星和顺铂加或不加甲氨蝶呤）,可治愈约70%的患者。肿瘤仅限于局部未发生转移的患者中,与总生存期的相关性最强的预后因素是术前联合化疗的有效反应。然而,近十年骨肉瘤的治疗进入了的平台期,甚至加大化疗药物的剂量或应用新的化疗药物于骨肉瘤患者其治愈率仍然没有有效提高。转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率在过去30年中基本保持不变,总体5年生存率约为20%。我们亟需探索新的骨肉瘤治疗方法。探讨骨肉瘤病理的分子机制,寻求相应的治疗靶点,有望从基因治疗层面突破骨肉瘤诊治的困境和瓶颈,达到早期诊断、早期治疗。NKAPL与NKAP具有高度同源性,在人类中其同源性可达64%。NKAPL与多种疾病的发生有着密切关联,先前的研究表明它参与了神经系统、生殖系统疾病的发展。近年有研究表明NKAPL在原发性肝细胞癌和乳腺癌中表达水平下降,证明它起到的是抑癌基因的作用。但NKAPL在骨肉瘤中的作用还未见报道。在骨肉瘤相关基因研究中,micro RNA（miRNA）是一个研究热点。许多研究表明,miRNA分子不仅能够参与调控骨肉瘤的生长微环境、肿瘤耐药性和肿瘤细胞的胞外分泌,还可用于制备纳米颗粒和靶向治疗骨肉瘤。分析miRNA分子在上述情况中的作用机制,将有助于为临床治疗OSA提供新的途径和手段。本研究的目的在于检测骨肉瘤组织和细胞株中NKAPL的表达水平,并分析NKAPL对于骨肉瘤增殖的影响。同时寻找调控NKAPL表达的miRNA,分析两者关系及调控机制。并且进一步探讨NKAPL调控骨肉瘤增殖的相关机制。为寻找骨肉瘤新的诊断和治疗的靶点提供思路。方法:1.我们首先收集了在安徽医科大学第一附属医院首次接受手术切除的56例骨肉瘤患者的肿瘤组织和对应的癌旁组织。将手术切除组织通过免疫组化和实时荧光定量PCR观察NKAPL在骨肉瘤癌组织和癌旁组织中的差异表达。统计这56例患者的临床病理特征,包括远处转移、临床分期、肿瘤大小、复发情况、淋巴结转移、化疗反应、病理分化、解剖部位、性别和年龄,分析这些特征与NKAPL表达水平的关系。2.选用人成骨细胞Nhost,人骨肉瘤细胞株MG63和U2-OS,通过实时荧光定量PCR和Western blot观察NKAPL在骨肉瘤细胞MG63、U2-OS与Nhost细胞之间的差异表达。3.通过生信分析软件预测可能对NKAPL的表达进行调控的miRNA,筛选出三个miRNA（miR-182-5p、miR-96-5p和miR-1271-5p）可能对NKAPL的表达进行调控。应用实时荧光定量PCR检测癌组织与癌旁组织中三种miRNA的差异表达,初步确定miR-182-5p可能调控NKAPL的表达,并且初步分析两者的相关性。4.miRbase预测NKAPL可能与miR-182-5p结合的位点,应用双荧光素酶报告进行验证。在人成骨细胞Nhost转染miR-182-5p mimics,在人骨肉瘤细胞株MG63和U2-OS分别转染miR-182-5p inhibitor,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测转染效率后,应用CCK-8检测转染后对细胞增殖的影响。5.分别在Nhost细胞中转染si RNA抑制NKAPL的表达,在骨肉瘤细胞MG63、U2-OS中转染NKAPL。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测转染效率后,应用CCK-8检测转染后细胞增殖能力的变化。在人骨肉瘤细胞株MG63和U2-OS分别转染过表达NKAPL后采用流式细胞仪检测细胞周期的变化。通过Western blot检测转染后的Notch1、hes1、hey2和cyclin D1的表达水平,初步分析NKAPL调控细胞增殖的机制。结果:1.56例骨肉瘤组织标本中的NKAPL蛋白和mRNA的表达水平明显低于癌旁组织,NKAPL mRNA低表达与远处转移（P=0.017）、临床分期（P<0.001）和肿瘤大小（P=0.023）有显著相关性,但与复发、淋巴结转移、化疗反应、病理分化、解剖部位、性别和年龄无显著相关性。2.人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS中NKAPL的mRNA和蛋白的表达水平均显著低于Nhost细胞。3.miR-182-5p在骨肉瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织,而miR-96-5p和miR-1271-5p在癌及癌旁组织中未发现差异表达。骨肉瘤组织中miR-182-5p的表达水平与NKAPL mRNA呈负相关。4.通过miRbase预测显示NKAPL与miR-182-5p的靶向结合位点是3’-UTR。应用双荧光素酶报告基因检测显示miR-182-5p能够靶向作用于野生型NKAPL 3’-UTR,而不能作用于突变型NKAPL 3’-UTR。在人成骨细胞Nhost转染miR-182-5p mimics后NKAPL的表达受到抑制并促进了细胞增殖,而在人骨肉瘤细胞株MG63和U2-OS分别转染miR-182-5p inhibitor后NKAPL的表达受到了促进并抑制了细胞增殖。5.在Nhost细胞中使用小干扰RNA（si RNA）抑制NKAPL的表达能够促进细胞增殖,在骨肉瘤细胞MG63和U2-OS中转染NKAPL能够抑制细胞增殖。在人骨肉瘤细胞株MG63和U2-OS分别转染过表达NKAPL后,通过Western blot检测到Notch1、hes1、hey2和cyclin D1的表达水平均明显下降,同时通过流式细胞仪检测发现细胞周期出现G0/G1间期阻滞,并且伴有G2/M期减少。这提示NKAPL可以通过下调Notch信号抑制细胞周期蛋白D1的表达,引起细胞周期阻滞,从而抑制了细胞增殖。结论:NKAPL和miR-182-5p在骨肉瘤的增殖中发挥着重要作用,miR-182-5p可以与NKAPL靶向结合从而抑制其表达,通过上调Notch信号影响细胞周期,进而促进骨肉瘤增殖。