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试验利用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测GC特异性受体、孕酮核受体与膜受体及TLR2、TLR4和NFκB的表达,从基因和蛋白水平上探讨GC介导外周PMN抑制的受体途径与细胞效应,为阐释GC在围产蒙古牛免疫抑制中的作用提供新的理论证据。 1.围产牛:选围产蒙古牛3头,于-14d,-10d,-7d,-3d,-1d,0d,1d,3 d,7d,10d,14d颈静脉采血分离PMN。mRNA丰度分析表明,GRα、GRβ、PR、PRB、mPRα、mPRβ在-14d~0d呈下降趋势,0d后呈时间依赖性上调(P<0.05);PGRMC1表达与围产期GC水平呈负相关;MyD88在临近分娩时迅速上调(P<0.05)后下降,但维持在高于产前水平(P<0.05);TLR2、TLR4均于产前平缓下降、产后升高;NFκB在临近分娩阶段呈上升趋势,并维持稳定表达。 2.阉牛体内注射:分别于注射DEX后0.25h、0.5h、1h、4h和8h采血分离PMN。mRNA丰度分析表明:GRα、mPRβ呈时间依赖性下调(P<0.05);mPRα、MyD88短时下调(P<0.05),而后维持稳定低表达;GRβ、PRB、NFκB短时升高(P<0.05)后降至注射前水平稳定表达;PR、TLR2迅速降至低水平并稳定表达(P<0.05);PGRMC1下调(P<0.05);短时刺激即上调TLR4(P<0.05)并维持高表达。 3.体外诱导:选取4ng/mL、16ng/mLDEX,分别建立DEX、DEX+LPS、DEX+RU486+LPS的PMN培养体系,于培养0.25h、0.5h、1h、4h和8h检测基因和蛋白。mRNA丰度分析表明:4ng/mL DEX诱导GRα、GRβ、PR、PRB、mPRα、mPRβ、MyD88、TLR2和TLR4的基因表达上调(P<0.05),NFκB短时上调(P<0.05)后抑制(P<0.05);16ng/mLDEX抑制GRα、GRβ、PR、PRB、mPRβ表达(P<0.05),上调NFκB和TLR4(P<0.05),而MyD88、mPRα和TLR2表达不变(P>0.05);4ng/mL、16ng/mL DEX与LPS共培养后,GRα、GRβ、PR、PRB、mPRα、mPRβ、TLR2、MyD88和NFκB表达上调(P<0.05),4ng/mLDEX+LPS上调TLR4表达(P<0.05),16ng/mLDEX+ LPS其表达不变(P<0.05);4ng/mL DEX+LPS+RU486共培养上调GRα、GRβ、PR、PRB、 mPRα、mPRβ、TLR2、TLR4表达(P<0.05),抑制MyD88表达(P<0.05),NFκB表达不变;16ng/mL DEX+LPS+RU486抑制PR、mPRα、mPRβ表达(P<0.05),上调GRβ、PRB、TLR2、TLR4、MyD88、NFκB(P<0.05),GRα无明显变化;而所有处理组的PGRMC1均下调(P<0.05)。 4.Western Blot检测显示,PMN表达GR、PR、mPRβ、PGRMC1、TLR2和NFκB蛋白。 结论:蒙古牛外周PMN表达GRα、GRβ、PR、PRB、mPRα、mPRβ和PGRMC1,并且能够介导GC对外周PMN的诱导效应,同时多数呈现显著的时间和剂量依赖性特征;GC通过其特异性核受体GRs介导其细胞效应外,PRB、mPRα和mPRβ可能发挥重要的介导作用。