HepG2细胞对HCV core免疫应答过程中ZIP8作用的初步研究

来源 :山东大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaowen51
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景:  丙型肝炎病毒(HCV)感染被认为是慢性肝炎的主要原因。慢性丙型肝炎患者首先发展为慢性炎症,导致肝硬化(20-40%),随后(4-6%的患者)发展成肝细胞癌(感染后的10-40年)。目前肝细胞癌的发病机制尚不明确,其与HCV相关性仍然存在争议,研究表明HCV蛋白可加强致癌转化。HCV-RNA基因编码多聚蛋白前体,可经病毒自身蛋白酶和宿主细胞作用后生成病毒体结构蛋白(核心蛋白和糖蛋白E1和E2)和非结构(NS)蛋白(p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B)。在体内HCV核心蛋白(HCV core)可通过各种信号途径来介导免疫反应,促使炎症的发生。  锌转运蛋白通过调节锌离子流入,流出和分布到细胞器中,来维持细胞内的锌稳态,包括免疫系统的稳态。锌转运蛋白包括两个蛋白家族:ZIPs(SLC39)和ZnTs(SLC30)。ZIPs转运蛋白使细胞质内锌离子含量升高,ZnTs转运蛋白使细胞质内锌离子含量降低,SLC39A8基因编码的ZIP8属于ZIPs蛋白家族。Begum等人研究发现在人类免疫刺激的单核细胞和分化的巨噬细胞中,ZIP8转运蛋白高水平表达。在ZIP8转染的细胞中,ZIP8主要定位于溶酶体上。研究显示,锌离子以ZIP8依赖的方式调节人体巨噬细胞中LPS介导的免疫反应,ZIP8敲除后会抑制在LPS驱动下的细胞内锌离子的积累,并使IL-10在mRNA水平上的表达升高。ZIP8通过调控Zn2+参与骨关节炎的发病机制。此外,ZIP8可通过NF-κB信号途径来负反馈调节促炎反应。  钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)属于蛋白磷酸酶2B家族,依赖于Ca2+/钙调素(CaM)调节,分布于许多哺乳动物器官。前期研究发现,在体外LPS刺激下CaN可以通过NF-κB信号途径来调节炎症因子的释放,如:IL-2,NO。在CaN催化结构域中,二价金属离子如:Zn2+和Fe2+为必要元素,并且在体外可被Mn2+和Ni2+激活。  研究目的:  检测正常人,丙肝患者和治愈后丙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ZIP8 mRNA的表达情况,探讨慢性丙型肝炎与ZIP8的关系。通过ZIP8过表达、RNA干扰和缺锌、加锌处理HepG2细胞来探讨HepG2细胞对HCV core免疫应答过程中ZIP8的作用。  实验方法:  1.临床标本  收集正常人(n=28),丙型肝炎患者(n=39),治愈后丙型肝炎患者(n=49)血液标本,用qRT-PCR方法来检测ZIP8 mRNA的表达。  2.HCV core对HepG2细胞ZIP8表达的影响  培养HepG2细胞,脂质体转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-HCV core质粒,24h后收集细胞,用qRT-PCR和Western blot方法检测ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表达。  3.ZIP8在HCV core免疫应答过程中的作用  (1) ZIP8、HCV core表达载体共转染HepG2细胞,设为三组: Vector、HCVc和HCVc+ZIP8,转染24h后,收集细胞。  (2) ZIP8 RNA干扰转染HepG2细胞,48h后,转染HCV core表达质粒,分为三组: Vector+NCsi、, HCVc+NCsi和HCVc+ZIP8si,继续培养24h后,收集细胞。  4.ZIP8通过调控Zn2+在HCV core免疫应答过程中的作用  (1)用2.5μM TPEN、50μM ZnCl2预处理HepG2细胞1h,然后转染HCVcore表达载体,设为四组: Vector、 HCVc、HCVc+ ZrCl2和HCVc+TPEN,继续培养24h后,收集细胞  (2) ZIP8 RNA干扰转染HepG2细胞,48h后,用50μM ZnCl2预处理HepG2细胞1h,然后转染HCV core表达载体,设为四组:Vector+NCsi、HCVc+NCsi、 HCVc+ZIP8si和HCVc+ZIP8si+ZnCl2,继续培养24h后,收集细胞。  以上收集的细胞用于提取RNA,细胞内蛋白,胞内核蛋白,进一步用qRT-PCR检测NF-κBp65、 IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达。用Western blot检测IKKβ、p-IKKβ以及核蛋白p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。  5.ZIP8和Zn2+对CaN活性的影响  提取各组细胞内蛋白,用CaN试剂盒检测各组CaN活性。  6.细胞内锌含量的测定  用锌离子荧光探针来检测HCVc、HCVc+ZIP8、HCVc+ZnCl2、 HCVc+TPEN、HCVc+ZIP8si和HCVc+ZIP8si+ ZnCl2这六组实验组中细胞内锌离子含量。  实验结果:  1.临床标本  与正常对照组相比,ZIP8 mRNA表达水平在丙型肝炎患者中显著降低;在治愈后丙肝患者中无明显差异。与丙肝患者相比,ZIP8 mRNA在治愈后的丙肝患者中表达显著升高。  2.HCV core上调HepG2细胞ZIP8的表达  与对照组相比,HCV core能够显著增加ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表达。  3.ZIP8在HCV core免疫应答过程中的作用  qRT-PCR结果显示:ZIP8过表达能够显著降低NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达;ZIP8 RNA干扰能够显著升高NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达。Western blot结果显示:ZIP8过表达能够显著降低IKKβ、p-IKKβ和核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。ZIP8RNA干扰能够显著升高IKKβ、p-IKKβ和核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。  4.ZIP8通过调控Zn2+在HCV core免疫应答过程中的作用  qRT-PCR结果显示:50μM ZnCl2加锌处理能够使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著降低;2.5μM TPEN缺锌处理能够使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著升高;当ZIP8被敲除后,50μMZnCl2加锌处理同样能够使NF-κBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著降低。Western blot结果显示:50μM ZnCl2加锌处理能够显著降低IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达;2.5μM TPEN缺锌处理能够显著升高IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达;当ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加锌处理同样能够显著降低IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。  5.ZIP8和Zn2+对CaN活性的影响  ZIP8过表达能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高;ZIP8 RNA干扰能够显著诱导CaN活性的升高;50μM ZnCl2加锌处理能够显著抑制由HCVcore诱导的CaN活性的升高;2.5μM TPEN缺锌处理能够显著诱导CaN活性的升高;当ZIP8被敲除后,50μMZnCl2加锌处理同样能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高。由此可见,ZIP8可通过调控Zn2+来抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高。  6.细胞内锌含量的测定  HCVc+ZIP8和HCVc+ZnCl2对应于对照组HCVc荧光强度明显增强;HCVc+ZIP8si和HCVc+TPEN对应于对照组HCVc荧光强度明显减弱;HCVc+ZIP8si+ZnCl2对应于对照组HCVc+ZIP8si荧光强度明显增强。  结论:  1.临床标本结果显示:与正常对照组相比,ZIP8 mRNA表达水平在丙型肝炎患者中显著降低;在治愈后丙肝患者中无明显差异。推测ZIP8可能与HCV感染有一定的联系。  2.体外实验显示,ZIP8过表达和Zn2+可显著抑制由HCV core诱导的炎症因子表达的上调,NF-κB以及CaN活性的升高,而沉默表达ZIP8和缺锌处理则呈现出相反的结果。由此可见,ZIP8可通过调控Zn2+抑制炎症的发生,具体的机制有待进一步研究。
其他文献
类胡萝卜素是广泛存于在自然界中一组结构多样的天然色素。在高等植物中,参与光复合体的光捕获,保护光氧化损伤,是植物激素ABA的前体。在人体和动物中,类胡萝卜素作为抗氧化剂和
由取代吲哚-3-甲醛和各种取代苯肼或取代苯肼盐酸盐在酸性条件下通过缩合反应生成-系列取代吲哚-3-甲醛芳香腙类化合物。 本文共合成了19个新的取代吲哚-3-甲醛芳香腙类化
大港石化公司轻烃泵很多,其密封基本采用接触式机械密封。由于轻烃介质具有高蒸汽压、低粘度、低引火点、高污染性等特性,而接触式机械密封由于端面摩擦热导致流体膜汽化使密封
在漫长的进化过程中,为了抵御病原菌的侵染,植物逐渐形成了一套非常复杂的防御机制,其中最为有效的是过敏性反应(hypersensitive response,HR),即在受病原菌侵染时,受侵染处及其周围