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本课题组经十余年的研究,已获得一大批体细胞融合再生植株。近年来,这些植株已陆续开花结果,对这些融合后再生的体细胞杂种、胞质杂种等材料的遗传背景、形态性状、开花结果习性、果实特征以及植株抗性等也已进行了研究。柑橘体细胞杂种在用于育种研究的同时,也为将其用于人工异源多倍体化后的基因组倍性效应及果实品质遗传等基础研究提供了珍贵试材,从而为指导柑橘细胞工程进一步用于育种实践提供理论支撑。与一年生作物相比,柑橘体细胞杂种可利用的新种质丰富、基因组遗传变异范围宽,并且具有可以无性繁殖和长期保存等优势,是基因组互作和核质互作研究的理想试材。本研究首先研究了多倍体化后基因组遗传和表观遗传变异特点,并以一组转EGFP基因的体细胞杂种为试材,分析了外源基因EGFP在多倍体化后的表达变化特点,最后利用Mt-GFP融合标记基因转化不同倍性伏令夏橙愈伤组织,以探讨倍性对外源基因转化的影响。主要研究结果如下：1、3组异源四倍体体细胞杂种基因组遗传和表观遗传分析。1)利用AFLP标记分析默科特橘橙+伏令夏橙,国庆1号+默科特橘橙和朋娜脐橙+粗柠檬3组体细胞杂种相对亲本基因组序列变化特点,每对引物扩增2.68-4.89条多态性谱带。叶肉亲本与体细胞杂种间的相似系数高于愈伤亲本与体细胞杂种间的相似系数,聚类分析显示叶肉亲本和体细胞杂种聚在一组,说明在异源四倍体体细胞杂种的核基因组中,叶肉亲本的基因组变异相对愈伤亲本基因组的变异较小。2)利用SSAP标记分析体细胞杂种反转录转座子变化特点,每对引物扩增4.11-6.16条多态性谱带,高于AFLP标记检测出的多态性。和AFLP分析基因组序列变化相似,SSAP标记分析也显示叶肉亲本与体细胞杂种间的相似系数高于愈伤亲本与体细胞杂种间的相似系数,聚类分析显示叶肉亲本和体细胞杂种聚在一组,两种标记分析都说明在异源四倍体体细胞杂种的核基因组中,叶肉亲本的基因组变异相对愈伤亲本基因组的变异较小。同时,SSAP标记分析的6个反转录转座子家族特点,推测其中RLC1反转录转座子家族可能在体细胞杂种基因组中发生变化,用Southern杂交验证了这个推论。3)利用MSAP标记分析体细胞杂种及其亲本基因组随机CCGG位点甲基化的特点及变化情况。3组材料均显示外侧胞嘧啶甲基化类型的位点比例最低,总体甲基化水平不同材料间存在差异,大约为29.57-48.70%。3组体细胞杂种基因组中愈伤亲本基因组随机CCGG位点甲基化的变化高于叶肉亲本基因组随机CCGG位点甲基化的变化。4)利用MSTD标记分析体细胞杂种及其亲本反转录转座子附近CCGG位点甲基化的特点和变化情况。与MSAP标记分析结果相似,外侧胞嘧啶甲基化类型的位点比例最低,但总体甲基化水平高于MSAP分析结果,大约为44.31-53.70%。3组体细胞杂种基因组中愈伤亲本基因组反转录转座子附近CCGG位点甲基化的变化高于叶肉亲本基因组反转录转座子附近CCGG位点甲基化的变化。2、3组同源四倍体基因组遗传和表观遗传分析。1)利用AFLP分子标记,分析椪柑、伏令夏橙和暗柳橙3组同源基因组加倍对DNA序列的影响,每对引物扩增0.09-0.47条多态性谱带,相似系数0.96-0.99。说明同源基因组加倍对基因组序列变化影响较小。2)利用SSAP分子标记,分析同源基因组加倍对反转录转座子活动的影响,每对引物扩增0.07-0.76条多态性谱带,相似系数0.93-0.99,和AFLP检测的结果相似,说明同源基因组加倍对基因组序列影响很小,可能没有发生转座子活动。3)利用MSAP标记分析同源基因组加倍对基因组随机CCGG位点甲基化的影响。不同材料总体甲基化水平存在差异,大约为30.13-34.92%。同源多倍体化基因组随机CCGG位点甲基化的变化在2.18-7.42%之间,低于异源四倍体体细胞杂种多倍体化后随机CCGG位点甲基化的变化。4)利用MSTD分析同源基因组加倍对基因组反转录转座子附近CCGG位点甲基化的影响。不同材料总体甲基化水平存在差异,大约为33.19-44.16%。反转录转座子附近CCGG位点甲基化的变化在3.28-10.19%之间,同样也低于异源四倍体体细胞杂种多倍体化后反转录转座子CCGG位点甲基化的变化。说明同源基因组加倍剂量效应对基因组的影响要低于异源基因组杂种性对基因组的影响。3、2组胞质杂种基因组遗传和表观遗传分析。1)利用AFLP分析默科特橘橙+伏令夏橙和国庆1号+HB柚2组胞质基因组对核基因组序列的影响。每对引物扩增0.36-1.23条多态性谱带,相似系数0.92-0.97。说明胞质基因组对基因组序列变化影响较小。2)SSAP标记分析胞质基因组对反转录转座子活性的影响,每对引物扩增0.50-1.04条多态性谱带,相似系数0.94-0.95,和AFLP检测的结果相似,说明同源基因组加倍对基因组序列影响很小,可能没有发生转座子活动。3)利用MSAP标记分析胞质基因组对基因组随机CCGG位点甲基化的影响。不同材料总体甲基化水平存在差异,大约为30.09-35.32%。胞质基因组对核基因组随机CCGG位点甲基化的变化在7.43-11.58%之间。4)利用MSTD分析胞质基因组对核基因组反转录转座子附近CCGG位点甲基化的影响。不同材料总体甲基化水平存在差异,大约为40.04-41.00%。反转录转座子附近CCGG位点甲基化的变化在7.75-8.24%之间。说明胞质基因组对核基因组的影响要低于异源基因组杂种性对基因组的影响。4、多倍体化对外源EGFP标记基因的表达影响。1)利用万能显微镜和激光共聚焦显微镜,从叶肉原生质体和叶片组织两个层次比较不同异源四倍体体细胞杂种默科特橘橙+转EGFP伏令夏橙、二倍体胞质杂种及二倍体亲本伏令夏橙材料间荧光强度的差异,结果显示：四倍体体细胞杂种的荧光强度明显低于二倍体胞质杂种和二倍体亲本。2)利用western杂交检测EGFP蛋白在不同倍性材料中的表达量,结果显示：EGFP蛋白在四倍体体细胞杂种的表达量明显低于二倍体胞质杂种。3)通过Southern杂交检测外源基因EGFP在不同倍性材料的插入位点和拷贝数,结果显示：外源EGFP基因在不同倍性材料中插入位点和拷贝数相同。4)通过Real-time PCR分析EGFP基因在不同倍性材料中的表达量,利用两个不同的内参,都证明EGFP基因在四倍体中的表达量明显低于二倍体胞质杂种。5、不同倍性伏令夏橙愈伤组织的转化。1)以伏令夏橙二倍体、同源四倍体、同源六倍体愈伤组织为外植体,通过根癌农杆菌介导方法,转化特异定位线粒体的Mt-GFP融合基因,获得二倍体伏令夏橙转化再生植株和同源四倍体、六倍体转化再生表达GFP荧光的胚状体。通过PCR、Southern杂交方法验证表达GFP荧光的再生植株中外源Mt-GFP基因的存在,表明GFP荧光与外源Mt-GFP基因检测上具有高度一致性。2)利用线粒体特异性染料Mito Tracker Orange与Mt-GFP蛋白在不同激发波长下的光谱特征,在单细胞原生质体水平证明Mt-GFP融合基因确实在柑橘线粒体内特异性表达。3)通过激光共聚焦显微镜观察比较定位线粒体(Mt-GFP)、内质网(Er-GFP)及细胞质(Cy-GFP)三种不同亚细胞定位的GFP在叶片、茎和根组织中的表达差异,表明不同亚细胞定位的GFP表达差异显著,其表达部位特点与GFP融合基因构建目的完全吻合。