乳腺癌是女性易患的恶性肿瘤之一,发病率居女性肿瘤第二位,且呈逐年上升趋势,严重危害广大妇女的健康。化疗是临床上常用的治疗手段,但多药耐药(Multidrug resistance, MDR)仍是导致乳腺癌化疗失败的重要原因之一。MDR形成机制复杂,其中P一糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的过表达介导的药物外排作用是主要的耐药机制。P-gp属于ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白超家族成员之一,由mdrl基因编码,是一种相对分子质量为170KDa的跨膜糖蛋白。P-gp的过度表达形成药物的转运泵,可与细胞内化疗药物结合并将药物泵到细胞外,以维持细胞内药物浓度在亚致死量的范围,从而产生耐药性。在大约30-40%的原发性乳腺癌和多于50%的转移性乳腺癌患者P-gp都高表达,因此研制能抑制P-gp表达及其功能的新型抗癌药是目前研究的热点。目前被证实具有逆转P-gp介导的MDR作用的药物和制剂很多,如维拉帕米(verapamil)、环胞多肽(cyclosporine)、三氟拉嗪(trifluroperazine)等,由于其有效逆转浓度往往超出临床应用的安全范围,在临床推广中存在不足。因此,寻找高效、低毒、作用靶点广、逆转作用显著的肿瘤MDR逆转剂刻不容缓。近期,人们发现一些传统中药在作为抗癌药同时具有逆转耐药效应,相对于西药,因其有效性和安全性而受到青睐。靛玉红是传统中药(tranditional Chinese medicine, TCM)复方“当归龙荟丸”(danggui longhui wan)的活性成分。在中国,当归龙荟丸被用于治疗慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)。靛玉红的确切作用机制虽尚不清楚,但其对CML的治疗取得了令人欣慰的结果,同时抗实体瘤的效应也被研究。研究表明,靛玉红衍生物对多种人类肿瘤细胞也具有抗癌作用。一些靛玉红衍生物,如indirubin-5-sulfonate和indirubin-3-monoxime I临床试验已取得可喜成绩。基于靛玉红属于氧化吲哚类这一事实,我们设计和合成了一系列的氧化吲哚类衍生物：Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ类,并经过构效分析,最终得到了抗癌效应最强的化合物：PH Ⅱ-7。前期研究发现,PH Ⅱ-7可抑制多种人肿瘤细胞生长,对多药耐药肿瘤细胞同样有效,体内实验证实对多种移植瘤有效。PH Ⅱ-7的一个主要的特征就是对多药耐药的肿瘤细胞同样有效。本实验选用乳腺癌敏感株MCF-7和高表达P-gp的多药耐药细胞株MCF-7/ADR,观察PHⅡ-7的抗癌和耐药逆转作用。结果表明,耐药株MCF-7/ADR相对于敏感株MCF-7对ADR的耐药倍数将近40倍,而PH Ⅱ-7对MCF-7/ADR和MCF-7均有生长抑制作用,IC50值接近,分别为6.07μM和5.51μM。用凋亡试剂盒Annexin-V FITC-PI则试结果表明,4μM的PHⅡ-7可诱导MCF-7/ADR将近20%的凋亡率。MTT和凋亡结果表明,PHⅡ-7可以显著抑制MCF-7/ADR细胞的增殖活性,并诱导其凋亡。用verapamil作为阳性对照,PH Ⅱ-7的逆转活性被进一步检测。在非毒性的浓度0.5μM.1μM和2μM, PHⅡ-7明显提高MCF-7/ADR对ADR的敏感性,表现为IC50值的浓度依赖性降低。相对于verapamil的54.68的耐药逆转倍数,0.5μM、1μM和2μM PHⅡ-7分别将MCF-7/ADR的IC50值137.80μgM降至108.20μM,18.64μM和0.55μM,逆转倍数分别为1.27,7.39,250.55。PH Ⅱ-7对MCF-7/ADR的逆转机制尚不清楚,因此,接下来的实验主要检测了PH Ⅱ-7对mdrl/P-gp的表达和外排功能的影响。Rhodamine123作为P-gp的荧光性底物,被用于检测P-gp的外排泵功能。结果表明,同verapamil相同,(0.5μM,2μM) PHⅡ-7可明显增加MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123的蓄积量,但对敏感株MCF-7无明显影响,提示PH Ⅱ-7可抑制P-gp的外排泵功能。进一步的研究表明,经PH Ⅱ-7作用后,MCF-7ADR细胞mdrl/P-gp表达明显降低。流式细胞仪检测对P-gp蛋白的检测结果表明,10μM verapamil导致了25.83%的P-gp表达下调,而0.5μM、IμM、2μM和PHⅡ-7对P-pg抑制率分别为1.35%、5.39%、14.72%和25.87%。4μM PHⅡ-7对P-gp的抑制率同10μM verapamil接近,但2μM PHⅡ-7的逆转效应是10μM verapamil的4.58倍。对P-gp表达和功能的双重抑制、诱导凋亡共同参与了PHⅡ-7的耐药逆转作用,强大的逆转效应保证了其应用的安全性。mdrl在转录水平可被多个转录因子调节。活化蛋白-1(activating protein-1, AP-1)是调节应激反应的重要的转录因子之一,由Fos和Jun蛋白家族的二聚体组成。AP-1是多个信号转导途径中的关键因子,在细胞分化、增生、凋亡过程中都起非常重要的作用。在乳腺癌细胞,AP-1已被证实为乳腺癌浸润和转移的重要的调节因子。此外,其他几条证据也使我们去调查AP-1在mdrl转录调节中的可能作用：(1) mdrl启动子区包含AP-1的重复位点,且位于启动子起始转录所必须的区域。(2)在几株人多药耐药细胞上已证实了c-fos、c-jun的过表达和AP-1活性的增强。AP-1活性的降低可增加对抗癌药的敏感性,提示了AP-1在MDR信号转导途径中的重要作用。作为AP-1的组成成分之一,c-fos在肿瘤发生、肿瘤细胞增生、转化、血管生成、肿瘤浸和转移中起非常重要的作用。在乳腺癌,c-fos的过度表达和预后成反比。c-fos基因的敲除能够延长乳腺癌移植瘤的存活时间,抑制乳腺癌细胞的增生和浸润。而且,研究表明,一些用于诱导多药耐药的药物如阿霉素、长春新碱(vincristine)、依托泊甙(VP-16)和秋水仙碱(colchicine),在应用过程中也引起c-fos表达水平的升高。这提示在多药耐药形成早期,转录机制的加强促进了P-gp表达增高。相对于敏感株MCF-7,耐药株MCF-7/ADR高表达c-fos mRNA和蛋白。而PHⅡ-7以时间和浓度依赖性的方式抑制MCF-7/ADR细胞的c-fos表达。4μM PHⅡ-7处理MCF-7/ADR24h后,c-fos蛋白水平明显下降,这和4μM PHⅡ-7对P-gp25.87%的抑制率相一致。为进一步确证c-fos在P-gp介导的多药耐药中的作用,用重组的干扰载体pSilencer3.1/sic-fos转染MCF-7/ADR细胞,干扰c-fos基因。并筛选出两株稳定单克隆细胞,MCF-7/ADR/sic-fos-8B和-3D,观察c-fos基因的抑制引起的耐药性的变化。转染结果表明,c-fos基因的抑制可下调mdrl和P-gp的表达,增加细胞内的Rhodamine123蓄积量,对ADR的敏感性增加。和c-fos的干扰程度相一致,MCF-7/ADR/sic-fos-3D因为c-fos干扰得更明显,因此表现出对ADR更强的敏感性、更多的细胞内Rhodamine123的蓄积、较少的mdrl/P-gp表达,这些结果更进一步确定了c-fos对P-gp介导的多药耐药的调节作用。综上所述,PH Ⅱ-7作为靛玉红衍生物之一,一方面可诱导耐药的乳腺癌细胞凋亡,另一方面可通过抑制转录因子AP-1,下调P-gp表达,逆转MCF-7/ADR的多药耐药。因此,PHⅡ-7具有抗癌和逆转耐药的双重作用。虽然靛玉红衍生物的抗癌作用已被广泛研究,但本研究首次报道了靛玉红衍生物具有逆转耐药作用。且强大的逆转耐药作用保证了其应用的安全性,优于传统的逆转剂verapamil。同时,我们的研究结果提示了c-fos可以作为耐药逆转剂的潜在的靶点之一。另外,本研究结果也为PHⅡ-7的临床应用(单独或与抗癌药联合应用)治疗多药耐药肿瘤提供了实验基础。