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IFN(Interferon,IFN)是以其干扰病毒复制的功能而被发现和命名的,是最先被发现的细胞因子。根据同源性及受体特异性不同,迄今为止,发现有三型IFN:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型IFN包括IFN-α(包括多个亚型)、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ以及IFN-ζ等;Ⅱ型IFN只有IFN-γ;Ⅲ型IFN是2003年才被发现的一种新型的IFN,包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3。其中,Ⅱ型IFN也被称为免疫干扰素,是体内重要的细胞因子。大量的研究表明,IFN-γ除具有广谱的抗病毒功能外,还能够通过调控免疫转录来协调机体的免疫反应,具有极为广阔的临床应用价值,因此成为当今免疫学、遗传学、分子生物学等众多学科研究最为活跃的领域之一,目前,人类IFN-γ已经用于临床多种疾病的治疗。由细菌、病毒等病原微生物引起的动物传染性疾病不仅制约了养殖业的发展,也给人类健康带来了巨大的隐患。IFN-γ的生物学功能使其具有防治动物传染性疾病的潜力,为了能将其应用于临床,人们一直在探索IFN-γ的生产,但都没能很好地满足临床应用的需要。随着基因工程的诞生和发展,用基因工程的方法选择高效稳定的表达系统,使生产大规模、高生物学活性、低生产成本的IFN-γ成为可能,这有利于IFN-γ的工业化生产,从而应用于临床,治疗动物性疾病及发挥免疫佐剂作用,实现其社会效益和经济效益。本研究以猪IFN-γ(poIFN-γ)为研究对象,探索poIFN-γ成熟多肽基因在高效外源蛋白表达系统P.pastoris中的分泌表达及大规模生产的条件,并对它的纯化工艺进行了摸索,为临床应用打下了基础。为了制备以P.pastoris表达的poIFN-γ的检测血清,先用高效表达外源基因的成熟表达系统—大肠杆菌表达系统对poIFN-γ进行表达以制备免疫用抗原,构建了原核表达载体pET-28a(+)-poIFN-γ,目的蛋白在大肠杆菌BL21 (λDE3)中以包涵体的形式得到了表达,纯化包涵体免疫小鼠,制备了poIFN-γ抗血清。同时构建了毕赤酵母表达载体pPIC9K- poIFN-γ,并电转化进毕赤酵母表达菌GS115中,通过遗传霉素抗性及诱导表达筛选出了稳定分泌表达poIFN-γ的毕赤酵母工程菌。将工程菌以逐步放大规模的方式进行培养,并在培养过程中摸索适于目的蛋白表达的最佳条件,最后在50L发酵罐中对poIFN-γ进行了大规模发酵,条件是:初始甘油浓度为40g/L的BSM培养基,以1/10接种量培养22-24h开始以甲醇诱导,细胞生长阶段罐内PH值为5.0,诱导表达阶段罐内PH值为6.0,溶氧保持在35%-45%,诱导表达48h,发酵液中目的蛋白含量为400mg/L。将发酵液离心,取上清,经中空纤维超滤浓缩后的样品通过疏水层析、凝胶过滤层析及离子交换层析得到了纯度达90%以上的poIFN-γ。对制备的poIFN-γ进行了免疫学活性及生物学活性的检测:poIFN-γ能与poIFN-γ抗血清发生特异性结合,证明其具有免疫学活性;以PK-15/PRV系统检测其生物学活性表明,真核表达的poIFN-γ抗病毒活性效价高达1.1×109U/mg,高于本研究中以原核表达并复性的poIFN-γ的活性(2.95×105 U/mg);以PK-15/HCV系统检测两个表达体系表达的poIFN-γ的生物学活性也证明了:真核表达产物具有更高的抗病毒活性。本研究首次以毕赤酵母发酵生产了具有高生物活性的poIFN-γ纯品,为临床应用打下了良好的基础。