捻转血矛线虫是寄生于反刍动物体内的一种重要消化道线虫,常给养殖业带来巨大经济损失。因抗蠕虫药物的的大量使用,耐药性虫株不断出现和蔓延,该病的防治工作面临巨大的挑战。人们力求通过分析捻转血矛线虫的全基因来开发新的兽药和疫苗。捻转血矛线虫第二期幼虫(L2)无感染性,蜕皮后发育为具有感染性的第三期幼虫(L3),L3侵入宿主后脱出鞘膜,标志着虫体从自由生活阶段转变为寄生生活阶段。本研究以L3为研究对象,将其分别与不具有感染性的L2和脱鞘第三期幼虫(xL3)进行比较蛋白质组学分析,筛选出一些差异性表达蛋白,为研究虫体侵入宿主的分子机制奠定了基础。1.第三期幼虫和活化第三期幼虫差异表达蛋白鉴定用双向差异荧光凝胶电泳(2D-DIGE)技术分析了 L3和xL3的蛋白表达图谱。在2200多个蛋白点中发现了 124个差异表达蛋白点(xL3/L3>1.5或xL3/L3<-1.5,p<0.05),其中83个蛋白点在xL3的表达量高于L3,41个蛋白点在xL3的表达量低于L3。所有的差异蛋白点通过质谱分析后共得到40个蛋白。对这40个蛋白进行了gene ontology(GO)分析,结果显示这些蛋白可能参与的生物过程有:信号转导、生物学调节、生物粘附、生长、定位等。此外,我们还进行了 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析,了解了这些蛋白参与的代谢过程和信号通路。2.第三期幼虫和第二期幼虫差异表达蛋白鉴定用2D-DIGE方法分析了 L2和L3的蛋白表达量的变化,在2200多个蛋白点中发现了 110个差异蛋白点(L3/L2>1.5或L3/L2<-1.5,p<0.05),在这110个差异蛋白点中有65个蛋白点在L2中表达量高于L3,45个蛋白点在L2中表达量低于L3。所有的差异蛋白点进行质谱分析后显示共有44个差异蛋白。这些蛋白主要是一些与代谢有关的酶类和运动相关蛋白。本研究揭示了从L2到L3发育过程中起作用的一些关键蛋白,在这一转变过程中某些蛋白也可能是潜在的优良抗原和药物靶位点。3.CPN60、Proteasome、Transthyretin 和 Peroxidase基因在L3 和 L3 阶段的转录差异性分析根据GenBank中捻转血矛线虫CPN60基因序列(登录号CDJ95307.1)、Proteasome基因序列(登录号CDJ96711.1)、Trasthyretin基因序列(登录号CDJ84219.1)和本实验室克隆到的Peroxidase基因分别设计引物,以捻转血矛线虫β-tubulin基因(登录号M76493.1)为内参基因,利用△ △CT法对上述4个基因在L3和xL3中的转录情况进行定量分析。结果发现CPN60基因在xL3中表达量低于L3,Proteasome基因在xL3中表达量高于L3,TransThyretin基因在xL3中表达量高于L3,Peroxidase基因在xL3中表达量高于L3。4.CPN60、Proteasome、Transthyretin 和Peroxidase(1293bp)基因克隆和原核表达根据GenBank中捻转血矛线虫CPN60、Proteasome、Transthyretin以及本实验室所克隆到的Peroxidase基因全长的其中一个开放阅读框(1293bp),分别设计引物;以捻转血矛线虫总RNA为模板;用RT-PCR方法,扩增到上述4个基因。将这些基因片段分别克隆到pMD19-T载体上,经酶切鉴定和序列分析,发现4个基因片段的大小分别为1710bp,696bp,411bp和1293bp。将上述基因片段分别亚克隆到pET-32a(+)载体上,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析结果表明这4种蛋白均成功表达,融合蛋白大小分别为81KDa、43.5 KDa、33 KDa和65 KDa。Western-blot显示这4种重组蛋白均可以被自然感染捻转血矛线虫的山羊血清所识别。