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目的:本研究建立大鼠心肌缺血预适应(IPC)模型,提取循环血中的细胞微囊泡(MVs),利用透射电镜(TEM)观察其超微结构,探讨IPC-MVs对在体大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的影响及与线粒体介导细胞凋亡途径相关的作用机制。方法:1.大鼠在体心肌I/R及IPC模型的建立健康雄性Wistar大鼠随机分为:假手术(Sham)、I/R及IPC三组。Sham组,于冠状动脉左前降支(LAD)下穿一丝线,不结扎;I/R组,LAD下穿线行缺血30 min,再灌注120 min,对心肌造成I/R损伤;IPC组,LAD下穿线对心肌先行短暂缺血/再灌注预处理,即缺血5 min,再灌注5 min,经历3个循环。再行LAD缺血30 min,再灌注120 min。实验全程监测标准Ⅱ导联心电图(ECG)、收缩压(SBP)及舒张压(DBP),记录缺血期各类室性心律失常(VA)的发生情况,TTC染色法测定心肌组织梗死范围,用于评价I/R及IPC模型。2.IPC-MVs的分离、提取及超微结构观察健康雄性Wistar大鼠麻醉后开胸,于LAD下穿一丝线,稳定15 min,进行3个循环的LAD缺血5 min,再灌注5 min后立即在腹主动脉取血,枸橼酸钠抗凝。大鼠循环血经2,600 g,15 min和10,000 g,5 min两步离心得到无血小板血浆(PFP)。采用33,000 rpm,148 min,4℃离心得到IPC-MVs,加无菌生理盐水得IPC-MVs NS混悬液。取部分混悬液用于透射电镜观察MVs的超微结构,剩余部分用于后期处理动物。采用2%磷钨酸染色液对IPC-MVs NS混悬液进行负染色处理后,置于透射电镜下观察。3.IPC-MVs对I/R大鼠MAP、HR、ST-段及心肌组织坏死的影响健康雄性Wistar大鼠随机分为:Sham、I/R及IPC-MVs+I/R三组。Sham组,LAD下穿一丝线后旷置148 min;I/R组,LAD缺血30 min,再灌注120min;IPC-MVs+I/R组,LAD缺血30 min,再灌注120 min,于缺血25 min时自股静脉注射依蛋白定量计算后的IPC-MVs 7 mg/kg,其他两组注射相同体积的NS。实验全程监测ECG,SBP,DBP。比色法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)活力,TTC染色检测心肌组织梗死范围,苏木素-伊红(HE)染色观察心肌形态学变化。4.IPC-MVs对I/R大鼠心肌细胞凋亡的影响实验分组及给药方法同3。分光光度法测定心肌组织caspase3活力,原位末端标记法(tunel)检测心肌细胞凋亡。5.ipc-mvs对i/r大鼠心肌组织中线粒体相关蛋白表达的影响实验分组及给药方法同3。westernblot法检测心肌组织中bcl-2及bax的蛋白表达水平。结果:1.成功建立大鼠在体心肌i/r及ipc模型i/r组,与缺血前比较,缺血期st-段显著抬高,于缺血30min达到峰值(0.495±0.059mvvs0.041±0.036mv,p<0.001)。室早(vpc)、室速(vt)及室颤(vf)发生率分别为100%、100%和75%。vpc出现时间为6.65±1.02min,个数为225±43。vt出现时间为8.24±1.17min,持续时间为0.68±0.14min。心肌组织梗死区(is)重量为94.85±20.15mg,梗死区与危险区比值(is/aar)为42.04±6.26%。与i/r组比较,ipc组缺血30min时st-段的抬高幅度明显下降(0.384±0.032mvvs0.495±0.059mv,p<0.001)。ipc组vt及vf的发生率明显下降(50%vs100%,p<0.05;25%vs75%,p<0.05),vpc及vt出现时间明显推迟(15.51±2.52minvs6.65±1.02min,p<0.001;17.59±1.34minvs8.24±1.17min,p<0.001),vpc个数明显减少(87±25vs225±43,p<0.001),vt持续时间缩短(0.29±0.18minvs0.68±0.14min,p<0.001)。is/aar明显下降(20.45±4.18%vs42.04±6.26%,p<0.001)。2.ipc-mvs的分离、提取及超微结构观察循环血经超速离心得到ipc-mvs,用bca法检测ipc-mvs的蛋白浓度为4.46mg/ml。透射电子显微镜下观察到ipc-mvs的膜性囊泡样结构,其直径大小在100-1000nm之间,呈圆形或椭圆形,外部为脂质深染区,内部为均一浅染区。3.ipc-mvs预处理改善i/r大鼠hr、st-段水平,并减轻心肌组织坏死i/r及ipc-mvs+i/r组平均动脉压(map)、心率(hr)、st-段的变化趋势均相同。与i/r组比较,ipc-mvs能显著加快再灌注120min时hr(361±15次/minvs344±14次/min,p<0.05),明显降低再灌注120min时st-段抬高幅度(0.023±0.012mvvs0.082±0.055mv,p<0.05)。ipc-mvs+i/r组再灌注120min时map虽略高于i/r组,但没有显著性差异。血清心肌酶ldh活力测定结果显示,与sham比较,I/R及IPC-MVs组缺血30 min及再灌注120 min均明显升高;与I/R组比较,再灌注120 min时IPC-MVs+I/R组LDH活力显著下降(11.345±0.756 U/mL vs 13.035±0.977 U/mL,P<0.01)。TTC染色结果显示,与I/R组比较,IPC-MVs+I/R组IS重量明显减小(62.28±8.75 mg vs 86.24±7.45 mg,P<0.01),IS/AAR的比值显著下降(28.73±4.02%vs 40.68±3.24%,P<0.01),HE染色观察显示心肌组织损伤明显减轻。4.IPC-MVs预处理抑制I/R大鼠心肌细胞凋亡通过TUNEL染色检测心肌细胞凋亡程度,并计算心肌细胞凋亡指数(AI)。结果显示,与I/R组比较,IPC-MVs+I/R组心肌细胞凋亡程度明显减轻,AI明显下降(19.98±1.51%vs 35.75±1.20%,P<0.001),心肌组织中caspase 3活力显著下降(52.43±2.55 U/μg vs 70.25±3.21 U/μg,P<0.001)。5.IPC-MVs预处理升高I/R大鼠心肌组织中Bcl-2/Bax比值Western blot结果显示,与I/R组比较,IPC-MVs+I/R组心肌组织中Bcl-2的蛋白表达量明显增多(0.81±0.11 vs 0.51±0.24,P<0.01),Bax的蛋白表达量明显下降(0.38±0.15 vs 0.60±0.13,P<0.01),Bcl-2/Bax的比值显著升高(1.54±0.25vs 0.86±0.17,P<0.001)。结论:1.大鼠在体心肌I/R及IPC动物模型制备成功。2.利用超速离心分离提取IPC大鼠循环血中的MVs,并成功利用透射电镜观测到IPV-MVs的超微结构。3.心肌I/R损伤模型大鼠股静脉注射IPC-MVs 7 mg/kg,可明显恢复再灌注120 min HR,降低再灌注120 min ST-段水平和血清LDH活力,缩小心肌梗死面积,减轻心肌组织坏死程度。4.心肌I/R损伤模型大鼠股静脉注射IPC-MVs 7 mg/kg,可显著减轻I/R损伤所致的心肌细胞凋亡。表现为降低心肌细胞AI和caspase 3活力。5.7 mg/kg IPC-MVs能够上调I/R心肌组织中Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,降低caspase 3活力。说明IPC-MVs对I/R损伤大鼠产生心肌保护作用的机制是抑制线粒体介导的细胞凋亡途径。