目的:肺癌是世界上主要的恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率均高居世界第一位,其中,80%~85%是非小细胞肺癌(NSCLC),主要包括肺腺癌、鳞癌与大细胞癌三种亚型。尽管现在免疫治疗、分子靶向治疗等手段兴起,也取得不错的临床疗效,然而目前临床可用的分子靶标数量有限,仅有EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET和C-MET等几个基因,而且主要集中于肺腺癌中。对于NSCLC的其他组织学亚型,目前关于肿瘤相关基因及靶向治疗的研究尚少。例如肺鳞癌中,仅有FGFR1、DDR2等几个基因,而且相关的药物大多还在临床试验阶段,临床效果仍有待于进一步试验。而对于大细胞肺癌,目前尚未发现有效的分子靶点。新的分子标记物、有效的分子治疗靶点,对于NSCLC进行早期诊断,判断预后和早期干预治疗,进而持续性控制NSCLC的发生发展、提高NSCLC患者的临床治疗效果具有重要意义。随着二代测序、蛋白芯片等高通量检测衍生的海量生物数据的出现,能够很好筛选新的有效的分子靶点,目前,可公开使用的数据库包括GEO、TCGA、STRING、GEPIA、K-M plotter、Oncomine、HPA等,本课题主要通过对生物信息学大数据分析,旨在:1、通过生物信息学方法分析NSCLC与正常肺组织差异表达的基因,以及筛选与预后相关基因,分析其生物学功能、细胞定位、参与的信号通路等,筛选在NSCLC发生发展过程中的关键基因。2、挑选上述关键基因中处于整个调控网络的核心基因(与其它基因关系最密切者),如TOP2A,研究其和NSCLC患者临床病理特征的关系,分析TOP2A影响NSCLC发生发展的具体分子机制,探索其作为NSCLC新的预后生物标志物的潜力和潜在的基因治疗靶点的可能性。方法:1、NSCLC发生发展相关基因的生物信息学分析(1)与正常组织相比,NSCLC差异表达基因的数据筛选(1)从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中挑选GSE44077、GSE18842和GSE33532三个基因/m RNA表达谱数据集,均用GEO2R在线分析工具分析,分析NSCLC和正常肺组织之间的差异表达基因(DEGs),调整后P值<0.05,|log2(fold-change)|≥1作为截断值的标准。(2)使用Venny2.1.0对上调和下调的差异表达基因分别取交集,筛选出共同差异表达的基因。(2)NSCLC中差异表达基因的功能分析(1)用Fun Rich3.1.0分析共同差异表达基因主要分布的细胞位置、发挥的分子功能和参与的生物学过程。(2)分析共同差异表达基因主要富集的分子信号通路。(3)核心基因的筛选及其功能富集(1)制作差异表达基因的蛋白质--蛋白质相互作用网络(PPI),利用Cytoscape3.6.0挑选出15个与周围基因高度相关性(度值Degree)的中枢基因。(2)采用Kaplan-Meier plotter分析中枢基因对NSCLC患者的预后意义,挑出其中与NSCLC患者生存预后直接相关、差异具有统计学意义的基因,作为核心基因。(3)利用检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具(STRING)对共同差异表达基因进行功能模块分析,阐述核心基因在哪些生物途径中发挥作用。2、所筛选的核心基因TOP2A在NSCLC中的表达及临床意义分析(1)TOP2A与临床病理特征关系的生物信息学分析(1)使用Oncomine数据库分析不同肿瘤类型中TOP2A的表达。(2)使用GEPIA数据库验证Oncomine数据库的分析结果。(3)用人类蛋白质表达图谱(HPA)数据库,分析TOP2A在NSCLC(肺腺癌和鳞癌)中的表达水平。(4)登入癌症基因组图谱(TCGA)网站,下载NSCLC患者临床病理资料(包含972临床患者信息,484例肺腺癌与489例肺鳞癌组织标本),分析TOP2A与NSCLC患者临床病理特征的关系。(2)TOP2A与临床病理特征关系的验证收集山西医科大学第二医院病理科和生物样本库的NSCLC样本以及对应的临床病理资料(107例临床患者信息,61例肺腺癌与46例肺鳞癌组织标本),制作组织芯片,进行TOP2A IHC,分析TOP2A与本地NSCLC患者临床病理特征的关系,并和大数据结果进行比较。(3)初步探索TOP2A影响NSCLC发生发展的分子机制(1)以TOP2A为中心,在STRING中绘制PPI网络,分析TOP2A以及与TOP2A相关关系蛋白所参与的主要分子信号通路。(2)利用Oncomine和STRING数据库首先筛选和TOP2A表达趋势相同的基因,进而使用GEPIA分析TOP2A和共表达基因之间具体的表达相关性(正相关、负相关、线性相关抑或曲线相关)。结果:1、NSCLC预后相关基因的生物信息学分析(1)共同差异表达基因的筛选及功能分析(1)三个GEO数据集GSE44077、GSE18842和GSE33532中,我们分别筛选得到1133、4459和3775个DEGs,分别包括691、2505、2351个下调基因和442、1954、1424个上调基因;(2)Venny2.1.0对三个数据集取交集结果显示,所有DEGs中,有232个上调的DEGs和432个下调的DEGs,共有664个DEGs在三个数据集中共存;提示这664个DEGs表达情况的可信度;(3)将664个共同DEGs进行功能分析,GO分析显示232个上调基因,主要与细胞周期和有丝分裂相关,432个下调基因主要富集在细胞通讯、信号转导、细胞粘附和质膜;KEGG分析显示上调的DEGs主要参与细胞周期/有丝分裂和DNA复制,下调的DEGs主要参与止血,血管壁的细胞表面相互作用和上皮--间质转化(EMT)上。(2)核心基因的确定和功能分析(1)Cytoscape3.6.0的插件cytohubba0.1计算共同差异表达基因的PPI网络,按degree方法(degree,度值被定义为该节点与网络中其他节点之间相互连接的数目,即相邻蛋白质的数量,这是节点最基本的参数)筛选出中枢基因,包括TOP2A、CDK1、CCNB1、CCKN3、NDC80、BUB1、CCNA2、MELK、CDC20、KIF23、PBK、KIAA0101、AURKA、CCNB2和MAD2L1;(2)Kaplan Meier plotter对15个基因的总生存分析显示有14个与患者总生存率显著相关(P<0.05),包括TOP2A、CCNB1、CCKN3、NDC80、BUB1、CCNA2、MELK、CDC20、KIF23、PBK、KIAA0101、AURKA、CCNB2和MAD2L1,把这14个基因作为核心基因进一步分析,结果提示14个核心基因的高表达与NSCLC的更差OS相关;(3)通过cytoscape3.6.0软件中的MCODE插件分析DEGs的功能模块,基于基因计数对其进行降序排序,FDR值也远小于0.05,结果显示664个共有DEGs主要富集在细胞周期、卵母细胞减数分裂、PI3K-Akt信号传导以及孕激素介导的卵母细胞成熟等信号传导途径,特别是在细胞周期中。2、TOP2A在NSCLC组织中的表达及临床意义(1)TOP2A与临床病理特征关系的生物信息学分析(1)利用Oncomine数据库分析TOP2A在人体各器官肿瘤中的表达水平,结果显示TOP2A在人类大部分肿瘤中是过表达的,包括肺脏在内的实体瘤和血液系统的恶性肿瘤,GEPIA数据库也验证了这一结论。此外,TOP2A的表达在不同的肺癌亚型中,也是一致性升高;(2)利用HPA数据库,采用TOP2A组化抗体(No:HPA006458)分析正常肺组织和NSCLC组织的免疫组化结果,结果显示正常肺组织TOP2A蛋白是低表达或不表达的,但在NSCLC中都是细胞核的强阳着色;(3)分析来自TCGA临床病理资料,TOP2A的表达仅与患者的年龄(P=0.035)和种族(P=0.018)有关,然而,它与NSCLC患者的组织学类型(腺癌和鳞癌)、性别、分期、位置、吸烟以及生存时间无关;(2)TOP2A与临床病理特征关系的验证分析TOP2A与本地NSCLC患者临床病理资料,TOP2A的表达与NSCLC患者的组织学亚型(腺癌和鳞癌)(P=0.000)、性别(P=0.001)和吸烟(P=0.006)有关,然而,它与NSCLC患者的年龄、分期、分化程度、位置、大小、被膜侵犯、支气管断端侵犯以及淋巴结转移无关,与TCGA数据对比存在差异。(3)TOP2A在NSCLC中参与的分子机制初步探索(1)以TOP2A为中心的PPI网络并对其进行富集分析,结果显示其KEGG以及Biological Process(BP)主要富集在细胞周期和有丝分裂;(2)Oncomine数据库中TOP2A的共表达分析发现TOP2A和TPX2具有很强的相关性;以TOP2A为中心的PPI网络,用共表达的形式演绎,也可以得出TOP2A和TPX2具有强的相关性,评分为0.993,与Oncomine的结果相一致。经过GEPIA的Pearson分析,我们发现TOP2A和TPX2具有正相关性,P值小于0.05,R=0.57。结论:1、应用生物信息学分析方法,我们揭示14个核心基因可能作为NSCLC新的预后生物标志物和NSCLC发展的可行基因靶点,其中TOP2A具有最强的度值;2、NSCLC和癌旁正常肺组织相比,TOP2A的表达水平升高,并且和患者的预后相关;3、TOP2A可能通过调控细胞周期影响肿瘤的发生发展,另外,TOP2A和TPX2在NSCLC的发生发展中可能具有协同作用。