论文部分内容阅读
目的：肝病是我国常见、多发病，严重影响患者生存率及生活质量。肝纤维化（liver fibrosisi）则是各种病因（肝炎病毒、酒精、血吸虫等）引发慢性肝病，并可发展至肝硬化或少数癌变，最终导致肝功能衰竭的必经阶段和共同病理基础。因此，肝纤维化的防治，逆转就成为阻断这一恶性发展链的关键环节。肝纤维化病理学基础为：肝脏细胞外基质（extra cellular matrix, ECM）合成增加，降解减少，导致肝脏内细胞外胶原过度沉积。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）是肝脏主要的胶原合成细胞。正常状态下，HSC处于静止状态；在特定条件下（如炎性因子、脂质过氧化（lipid peroxidation，LP））等被激活后，其胶原合成能力显著增加；故HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的主要细胞学基础。因此，抑制HSC的活化、增殖，诱导活化HSC的凋亡，促进胶原的降解是阻止、逆转肝纤维化的主要途径。目前，西医对于肝纤维化尚无良好治疗方法。与此同时，中医药在抗纤维化治疗中显露出可喜效果。本研究拟从细胞及分子水平探讨临床有效的活血化瘀中药丹参、中药组方“益肝康”抗纤维化的体内作用机制，即：两种中药及组方的体内转化产物对HSC表型及功能影响。同时采用秋水仙碱作为抗纤维化西药对照，观察丹<WP=4>参、“益肝康”、秋水仙碱三种药物对体外培养的HSC中LP、核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及HSC活化、增殖的影响，比较三种药物抗纤维化的疗效及作用机制。同时，本研究采用将动物进行肝纤维化造模后，再进行药物灌服，提取药物血清的“改良血清药理学方法”，有别于采用正常动物作为药物血清供体的“传统血清药理学方法”，探讨改良血清药理学方法的可行性及其与传统血清药理学方法的异同点。方法：分别采用传统及改良血清药理学方法制备药物血清；各组药物血清作用于体外培养HSC，观察各药物血清对HSC表型及HSC中MDA、NF-κB、α-SMA及细胞增殖率的影响。1.分别采用传统及改良血清药理学方法制备药物血清：①采用清洁级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠80只，230-260克，随机分为8组，如下：A组：正常大鼠组 A1组：丹参组 A2组：益肝康组 A3组：秋水仙碱组 A4组：正常对照组B组：病理大鼠组 B1组：病理丹参组 B2组：病理益肝康组 B3组：病理秋水仙碱组 B4组：病理对照组B组大鼠进行肝纤维化造模，40％CCl4皮下注射，首次4ml/kg，后为2ml/kg，2次/周，共持续9周。A组<WP=5>大鼠采用0.9％生理盐水皮下注射，剂量、时间同B组CCl4。②9周后，A、B组各随机处死2只大鼠，观察其肝脏组织病理学改变。.③9周后，各组大鼠灌服相应药物（药量为成人每日每公斤体重用量10倍），每日分2次灌服，早晚各一次，共持续5天。.第4天晚开始禁食；第5天晨灌药2小时后，大鼠麻醉、下腔静脉取血， 4℃、3000转/分钟、离心20分钟，取上层淡黄色透明样血清，56℃，水浴灭活30分钟。-70℃保存备用。.④使用前，将所需剂量的血清从-70℃取出，37℃水浴解冻。使用一次性滤器过滤血清后，使用8％RPMI-1640培养液将药物血清配制为10％药物血清-1640培养液。2.药物血清体外培养HSC及指标检测：在5％CO2细胞培养箱中，待HSC在8％RPMI-1640培养液中贴壁后，换用无血清RPMI-1640培养液培养过夜，次日晨换用各组10％药物血清-1640培养液干预细胞，观察细胞形态变化，进行指标检测。①细胞生长抑制率：MTT法②NF-κB、α-SMA：细胞免疫化学染色③MDA：TBA缩合比色法。结果：1 造模9周时，B组大鼠肝脏内已出现明显的细小纤维组织增生，局部有完整假小叶形成；肝细胞出现空泡变性、炎性坏死等病理学改变。A、B组药物血清均可维持HSC贴壁、生长、分裂，但细胞生长、分裂速度较纯8％RPMI-1640培养液减慢，且细胞逐渐失去典型表型，突触逐渐减少、缩短，胞体胀圆。2 药物血清对细胞增殖的抑制率（MTT法）：A1、A2较A3、A4明显抑制HSC增殖，有统计学差异（P<0.05）。其中， A2作用强于A1；B1、B2较B3、B4明显抑制HSC增殖，<WP=6>有统计学差异（P<0.05）。其中， B2作用强于B1；B组药物血清抑制作用稍强于A组相应同种药物血清。3 各药物血清组培养上清液MDA含量较对照组均减少，其中以A1、A2及B1、B2作用较强。B组药物血清抑制作用稍强于A组相应同种药物血清。4 各组药物血清均使α-SMA、NF-κB表达下降。其中，A1、A2作用强于A3、A4；B1、B2作用强于B3、B4；B组药物血清抑制作用稍强于A组相应同种药物血清。结论：1正常大鼠及肝纤维化大鼠三种药物血清（丹参，益肝康，秋水仙碱）均可用于HSC的体外培养，并对HSC的活化、增殖均有抑制作用，中药作用强于秋水仙碱。同时，肝纤维化大鼠病态药物血清较正常大鼠药物血清作用增强，可能由于病态肝脏对药物的代谢减慢，间接造成药物有效成分作用时间延长或CCl4造模中产生抑制性细胞因子对药效的发挥起到协同作用。2 三种抗肝纤维化药物（丹参、益肝康、秋水仙碱）通过抑制LP而抑制NF-κB的活化，从而抑制HSC转录的启动