程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)是T淋巴细胞表面的一类免疫抑制性受体，通过与其配体相互作用介导PD-1/PD-L1信号通路的激活，继而在外周及中枢免疫系统中发挥着重要的负调节作用。鼠与人免疫抑制类疾病的相关研究结果表明，作为PD-1/PD-L1(ligands of programmed death-1,PD-L1)信号通路激活的重要前提，二者的异常上调表达受到多种因素调控。与其它仅能刺激单一种类细胞表面PD-1及PD-L1表达的因素相比，IFNs则在诱导二者上调表达方面表现出了更为广泛的细胞种类适应性，特别是对CD4+、CD8+T淋巴细胞表面的PD-1及PD-L1表达上调效果更为显著。这些已有研究结果提示，PD-1及其配体PD-L1两种分子的表达很可能受到IFNs介导的相关信号通路所调控。特别是鼠源PD-1分子表达调控机制的相关研究中，在PD-1基因序列上游存在IFNs调控基因表达的ISRE顺式作用元件结合位点的发现，更是将这种可能性进一步指向与其相关的STAT/JAK信号通路。目前，畜禽相关的PD-1/PD-L1信号通路激活所导致的免疫抑制机制的研究相较于人类及鼠领域仍处于探索阶段，关于PD-1或PD-L1表达调控的分子机制研究更是鲜有报道。结合现有的相关研究进展，本课题前期研究证实鸡PD-1及其配体PD-L1的上调表达与IBDV感染后导致的免疫抑制以及ChIFNs的异常分泌密切相关的基础上，探讨ChIFNs对鸡PD-1及PD-L1表达的调控作用及其分子机制。本研究通过分离具有活性的高纯度鸡CD4+ 、CD8+T淋巴细胞，并以之为研究对象，分别对不同ChIFNs刺激条件下鸡PD-1及其配体PD-L1的表达模式和抑制ChIFNs相关下游主要信号通路对PD-1及PD-L1表达的影响进行研究，并对ChIFN-γ刺激后STATs信号通路激活与PD-1及PD-L1的表达关系进行了初步分析。　　1、利用荧光定量PCR和Western-blot检测技术分别对ChIFN-α、β和γ刺激条件下，鸡CD4+、CD8+T淋巴细胞PD-1及其配体PD-L1的核酸及蛋白的表达模式进行研究。结果表明：（1）ChIFN-α(200 ng/mL) 刺激30 min后，鸡PD-1及PD-L1表达水平分别达到峰值，较空白对照组分别升高7倍左右，变化差异极显著（P<0.01），随后逐渐下降，至120 min恢复至正常水平；（2）在同等剂量条件下，鸡PD-1 和PD-L1 分别在ChIFN-β刺激60 min 和30 min 达到峰值，较空白对照组分别升高12倍左右，变化差异极显著（P<0.01），PD-L1较PD-1对ChIFN-β的刺激更为敏感；（3) ChIFN-γ在诱导二者的上调表达方面，特别是对PD-L1的上调表达，较另外两种I型干扰素则表现了更为显著的效果，二者分别在ChIFN-γ刺激作用60 min和30 min达到峰值，其峰值较对照 组分别升高约24倍(PD-1)和近50倍(PD-L1)；（4）Western-blot对各实验组相同时间点PD-1及其配体PD-L1的蛋白表达水平检测结果，与二者核酸水平的变化规律检测结果基本一致。以上结果表明，ChIFN-α、β和γ三种干扰素均可诱导鸡CD4+、CD8+T淋巴细胞PD-1及其配体PD-L1的上调表达，并在效果上呈依次增强趋势，同时在所研究的干扰素浓度范围内(100 ng/mL和200 ng/mL)均表现出一定的剂量依赖性关系。　　2、在明确了ChIFNs对鸡PD-1及其配体PD-L1具有上调表达作用的基础上，为进一步探究其分子机制，分别对IFNs介导调控免疫调节相关基因转录表达的下游主要信号通路STATs、PI3K 、JNK和PKC进行抑制，研究上述各信号通路与 ChIFNs 上调 PD-1 及 PD-L1 表达之间的关系，分别采用 AG490 （JAK/STAT通路抑制剂）、LY294002（PI3K通路抑制剂）、rottlerin（PKC通路抑制剂）和SP600125 （JNK通路抑制剂）对上述方法分离制备的鸡CD4+、CD8+T 细胞进行预处理，未经抑制剂处理的细胞为对照组，然后利用不同ChIFNs分别对不同抑制剂预处理组进行刺激，于30 min、60 min、120 min、150 min分别收集细胞提取RNA后进行研究各干扰素相关信号通路抑制后PD-1、PD-L1表达变化情况。结果表明：（1）ChIFN-α诱导鸡CD4+、CD8+T细胞PD-1的上调表达很可能是通过STATs、JNK和PKC相关信号转导通路激活得以实现的（与PI3K信号通路无显著关联）。而其诱导PD-L1的上调表达则可能是通过STATs和PI3K相关信号转导通路激活实现的（与JNK和PKC无显著关联性），上述有效的信号通路抑制剂对ChIFNα诱导PD-1及PD-L1上调表达的抑制影响均呈现显著性关系（P<0.05）；（2）ChIFN-β诱导PD-1的上调表达与ChIFN-α诱导PD-1上调表达所经的可能通路相同，也是STATs、JNK和PKC三条信号通路，所不同的是分别抑制上述三个信号通路后对ChIFN-β诱导PD-1上调表达的影响作用表现更为显著（P<0.01）。而ChIFN-β诱导PD-L1上调表达则可能是通过STATs、JNK和PI3K信号转导通路激活得以实现（与PKC信号通路无显著关联性），且分别抑制上述三个信号通路后对ChIFN-β诱导PD-L1上调表达的影响作用极为显著（P<0.01)；（3)与ChIFN-α和β不同的是，ChIFN-γ调控PD-1及PD-L1上调表达的相关信号通路则体现了更为广泛性的特征，其中STATs、PKC和JNK与ChIFN-γ调控PD-1的上调表达呈现了极为显著关系（P<0.01），PI3K与ChIFN-γ调控PD-1的上调表达呈现了显著关系（P<0.05），而ChIFN-γ调控PD-L1的上调表达则与STATs、PKC、JNK和PI3K四个信号通路均呈现极显著（P<0.01）的关联性。综合以上结果，不同ChIFNs诱导 PD-1或PD-L1的表达上调很可能是通过多条IFNs下游相关信号通路共同介导得以实现的，这些参与调控PD-1或PD-L1表达的信号网络之间的内在关联性，还需要后续深入研究进一步揭示。结合不同抑制剂对PD-1或PD-L1上调表达影响的显著性的结果来看，STATs较其它通路与ChIFN-α、β和γ三者诱导PD-1及PD-L1表达上调均存在紧密的关联性，且抑制该信号通路对二者的表达上调呈现了更为显著的影响（P<0.01），STATs很可能是不同ChIFNs调控鸡PD-1和PD-L1上调表达的共同信号通路之一。　　3、以 ChIFN-γ和 STATs 信号通路为主要研究对象，本部分主要利用Western-blot技术对ChIFN-γ作用条件下，AG490抑制剂对STAT1的磷酸化，以及PD-1及PD-L1表达影响进行研究，进一步分析明确ChIFN-γ作用下STATs信号通路激活与PD-1及其配体PD-L1表达之间的关系。结果表明：（1）STAT1蛋白的磷酸化水平随ChIFN-γ刺激时间的增长逐渐升高，至60min时STAT1磷酸化水平升高最为显著。同时，利用AG490抑制剂预处理，可显著抑制ChIFN-γ刺激60 min时引起的STAT1高水平磷酸化，表明STATs信号通路在ChIFN-γ作用60 min后能够被显著激活，且AG490对STATs信号通路的激活具有显著的抑制效应。（2）ChIFN-γ可显著诱导鸡CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1及PD-L1的蛋白表达水平，二者均在ChIFN-γ刺激60min后达到峰值，而AG490可显著抑制二者在峰值时间段的表达升高。上述结果表明，STAT1蛋白的磷酸化水平与PD-1及PD-L1的表达水平呈现显著正相关，进一步证实STATs信号通路是ChIFN-γ调控鸡PD-1及PD-L1上调表达的主要信号通路之一。　　以上结果，为进一步在PD-1及PD-L1基因编码区域上游筛选调控二者表达的STATs相关顺势作用元件（ISRE或GAS）、丰富PD-1/PD-L1免疫抑制信号通路激活引起的禽类免疫抑制和持续性感染疾病的防控提供理论指导、并为从基因转录水平上寻求能够阻断或抑制由于PD-1/PD-L1免疫抑制信号通路激活引起的禽类免疫抑制和持续性感染疾病的靶点奠定基础。