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增加难溶性药物的溶解度是药剂学研究的热点之一,而油水均不溶性药物给药系统的研究更是其中的难点问题。本课题将纳米粒和水包油（O/W）亚微乳相结合,制成新型的水包油包纳米粒（N/O/W）亚微乳给药系统,将纳米粒包载在亚微乳的油相中,以达到增加制剂中难溶性药物载药量的目的。制剂中采用生物相容性好的辅料,安全性好,可实现难溶性药物的静脉注射给药。N/O/W亚微乳可进一步制成干乳剂,提高稳定性不好的药物在制剂中的稳定性。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）是青蒿素经还原而成的半缩醛化合物,具有良好的抗疟作用,近代研究表明DHA对多种人类和动物肿瘤细胞均有杀伤作用,且治疗浓度下对正常细胞几乎无毒性作用,有希望发展成为新型的抗肿瘤药物。DHA为难溶性药物,分子结构中存在特殊的过氧基团,稳定性差,胃肠道降解严重,生物利用度低。本研究以双氢青蒿素为模型药物,采用生物相容性好的辅料制备了注射用DHAN/O/W亚微乳剂,可实现DHA的静脉注射给药。同时针对DHA稳定性不好的特点,进一步制成干乳剂,提高DHA在制剂中的稳定性。本课题建立了DHA的HPLC含量测定法,考察了DHA在溶液中异构体的转化平衡情况,α-DHA与β-DHA在溶液中达到平衡所需时间约为10h,平衡后二者的比例不再变化,比例约为2.3（α/β）。在转化过程中DHA异构体总峰面积基本保持恒定,对DHA的HPLC分析可用α-DHA与β-DHA峰面积之和与浓度进行线性回归,计算DHA的含量。测定了DHA在不同溶媒中的溶解度,DHA在水和大豆油中的表观溶解度分别为0.119±0.021和1.24±0.01mg/mL,在水和大豆油中加入不同乳化剂后,均能提高DHA的溶解度,其中以大豆油/大豆磷脂/胆固醇最为显著。以注射用大豆油、大豆磷脂、胆固醇和稳定剂C为油相,Poloxamer188、甘油为水相,采用微射流技术制备DHA N/O/W亚微乳。乳剂外观为乳白色液体,无油花,不挂壁,用水稀释后有淡蓝色乳光。平均粒径为152±18nm（PDI0.078±0.018）,Zeta电位为-33.28±2.07mV,pH值为7.18±0.03,符合注射要求。DHA N/O/W亚微乳中药物含量为2.98±0.03mg/mL,载药量约为DHA O/W亚微乳最高载药量的3倍。以DHAO/W亚微乳作为对照,分别在光学显微镜、透射电镜、冷冻蚀刻透射电镜下观察不同粒径DHAN/O/W亚微乳的形态。结果显示,DHAN/O/W亚微乳呈椭圆状,边缘光滑,乳滴大小较均匀,乳滴中包含有颗粒状物质,DHA O/W亚微乳中则未观察到有颗粒状物质存在。冷冻蚀刻透射电镜可见DHAN/O/W亚微乳乳滴断面不平整,具有类似于层纹或壳状的结构存在,而DHA O/W亚微乳的乳滴断面较光滑平坦。以多种可代表DHA纳米粒不同状态的DHA制剂和DHA纯品为对照,进行DHA N/O/W亚微乳的DSC分析试验。与DHA纯品相比,DHA N/O/W亚微乳剂和DHA油混悬液中DHA的熔点下降了接近10℃。而DHA水混悬液和模拟DHA分散在N/O/W亚微乳水相的制剂中DHA熔点与DHA纯品的熔点相近。通过DHA的熔点变化情况判断,DHAN/O/W亚微乳剂中DHA的存在位置应在制剂的油相中,与显微镜的结构观察结果相符。考察了DHA在N/O/W亚微乳中的分布情况。经测定DHA N/O/W亚微乳剂约有8.06%的药物溶解在水相中,91.9%的药物存在在油相中。其中有13.8%的药物溶解在油相中,其余78.1%的DHA存在于界面膜和油相的纳米粒中。以甘露醇:蔗糖（4:1）为冻干保护剂制备了DHA N/O/W干乳剂,干乳中冻干保护剂与油相的比例为2:1（w/w）。冻干过程为DHA N/O/W亚微乳与冻干保护剂混合均匀后,在-40℃迅速冷却预冻6小时,然后在-40℃真空干燥4小时,-40℃～0℃真空干燥8小时,升温至20℃持续4小时去除残余水分,冻于过程中压力保持在30-50mTorr,冷凝器温度控制在-80℃。建立了DHA有关物质的HPLC分析法,采用强制破坏法制备了在强酸、强碱、光照、高温和氧化条件下破坏的样品,找到了7个DHA的降解产物。DHA的降解产物在本分析方法下均能达到良好分离,本法可用于DHA制剂的稳定性研究。考察了DHA、DHAN/O/W亚微乳剂和DHAN/O/W干乳剂的稳定性。结果表明,DHA对光照和高温敏感,在湿度较高的环境下含量也有改变,故应低温干燥避光保存。考察了DHA在溶液中的稳定情况。与DHA溶液相比,DHA N/O/W亚微乳的稳定性已有提高,但对温度仍然很敏感,在光照条件下不稳定。DHAN/O/W亚微乳需放置在4℃,充氮避光密闭保存。对DHA N/O/W干乳剂进行了加速试验和长期留样观察。DHA N/O/W干乳经25℃、60%RH加速试验6个月,含量下降4%,复溶时间略微延长,粒径分布、Zeta电位和pH值没有显著变化。4℃长期留样观察9个月内制剂性状、药物含量等均无明显变化。在此条件下DHAN/O/W干乳剂质量稳定,长期试验仍在进行中。通过异常毒性检查、血管刺激性试验以及溶血性试验对DHA N/O/W亚微乳剂的安全性进行了初步评价。DHA N/O/W亚微乳剂对小鼠的异常毒性试验合格,制剂在生产过程中未带来异常的毒性。对家兔耳缘静脉无明显刺激作用,对家兔红细胞无明显体外溶血及致凝集作用,DHA N/O/W亚微乳剂用于静脉注射是安全的。建立了体内样品中DHA含量测定的HPLC-MS分析方法。方法专属性好,内源性杂质对样品测定无干扰,样品处理简单,精密度、回收率均符合规定,可用于DHA的体内分析。以DHA和DHA O/W亚微乳剂为对照,考察了DHAN/O/W亚微乳剂与家兔、大鼠和人血浆的血浆蛋白结合情况。在本试验研究的浓度范围内,不同浓度的DHA制剂在同种血浆中的蛋白结合率无显著差异,蛋白结合率与药物浓度无关。不同制剂在同种血浆中的蛋白结合率也没有显著差异。不同种血浆当中,DHA与家兔的血浆蛋白结合率较高,其次为大鼠和人的,DHA与血浆蛋白具有中等强度的结合,平均血浆蛋白结合率分别76.36%、66.34%和63.94%。家兔体内药动学研究结果显示,DHA N/O/W亚微乳和DHA O/W亚微乳可以显著延长DHA的体内循环时间,提高血浆中药物浓度。DHA N/O/W亚微乳和DHA O/W亚微乳的MRT分别为DHA溶液剂的的10.39和3.42倍,DHAN/O/W亚微乳为DHA O/W亚微乳的3.03倍。DHA N/O/W亚微乳和DHA O/W亚微乳的AUC分别为DHA溶液剂的3.01和1.80倍,DHA N/O/W亚微乳为DHAO/W亚微乳的1.67倍。小鼠组织分布研究表明,DHA在体内迅速转化成一未知成分,在血液样品中可观察到转变情况,各组织中仅检测到该成分的存在。经固相萃取分离提取,HPLC-MS分析得到该成分的质谱图,该成分具有m/z 267.1的碎片离子峰提示其结构中仍有过氧基团的存在,应仍具有与DHA类似的药效。考察了该成分在小鼠体内的消除分布规律,研究DHA N/O/W亚微乳剂的组织分布趋势。结果表明,DHA亚微乳剂可延长药物在体内组织脏器中的滞留时间,在肝的摄取最高。DHA N/O/W亚微乳剂和DHA O/W亚微乳剂的体内分布趋势有所不同,DHA N/O/W亚微乳剂在心脏的分布降低,而在血中的滞留时间和在胃、脑中的分布增加。以H22荷瘤小鼠模型进行DHA N/O/W亚微乳剂抗肿瘤药效学的研究。乳剂给药剂量为45mg/kg时,抑瘤率达51.8%（P＜0.01）,给药剂量为11.25mg/kg时,抑瘤率为23.0%,低剂量乳剂组药效略高于同等剂量的溶液组,高剂量的溶液对照组给药后溶媒毒性超过了动物的耐受剂量,因此未得到高剂量溶液组的数据。结果表明,45mg/kg的DHA N/O/W亚微乳剂对H22肿瘤细胞具有显著抑制效果。对小鼠肿瘤的免疫组化结果分析表明,DHA可下调VEGF的表达,高剂量乳剂组尤为明显,对各组组织切片的MVD观察结果表明,MVD与VEGF表达结果趋势相同,DHA可能是通过抑制肿瘤细胞的血管生成来抑制肿瘤的生长。通过DHAN/O/W亚微乳的处方与工艺筛选、制剂特征、稳定性、安全性考察,动物组织分布、体内药物动力学、以及抗肿瘤作用的研究,表明N/O/W亚微乳具有以下优点:（1）可提高油水均不溶性药物的载药量;（2）使用生物相容性好的辅料,制剂安全性好,可适用于静脉注射给药;（3）以亚微乳作为纳米粒的载体,可增加纳米制剂的物理稳定性;（4）可进一步制成干乳剂,增加不稳定药物的化学稳定性;（5）能够改变药物在体内的组织分布和药物动力学性质,有可能进一步开发成靶向制剂;（6）易于工业化生产。本课题为N/O/W亚微乳新剂型的研究奠定了基础,为难溶性药物给药系统的研发提供新思路。DHA N/O/W亚微乳的研究可为疟疾重症患者提供急救用药,同时也可为研发双氢青蒿素抗肿瘤作用新用途提供制剂。