目的:S037 为抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate,ADC),由靶向 HER2 的抗体通过稳定硫醚连接物SMCC与微管抑制剂DM1共价连接,临床拟用于肿瘤的治疗。首先对食蟹猴血清中S037和KadcylaTM总抗体和偶联抗体含量测定的分析方法以及对食蟹猴血清中的抗药抗体测定的分析方法进行验证,确保方法的精确性、可靠性和灵敏度,以便将该方法应用于食蟹猴血清样本分析。通过食蟹猴连续8周期静脉给予S037,停药恢复6周,初步获得临床前安全性信息,为后期临床试验设计提供参考。另一方面,通过与已上市同类药物KadcylaTM进行毒性对比,桥接该药物已有的毒性数据,为指导临床试验提供依据。方法:食蟹猴血清中S037和KadcylaTM总抗体和偶联抗体含量测定的分析方法为ELASA法;方法学验证内容,包括标准曲线重现性、选择性、批内和批间准确度与精密度、特异性、稀释线性、胡克效应、平行性、稳定性和受试样本再分析等;S037和Kadcyla对方法学的响应可比性。食蟹猴血清中的抗药抗体测定的分析方法为桥接ELISA方法;方法学内容包括,筛选试验Cut point值和确证性Cut point值;系统适应性(QC样品接受标准);灵敏度;精密度;基质效应/选择性;药物耐受;Hook效应;质控样品稳定性。根据体重将50只食蟹猴(雌雄各半)随机分成5组,静脉给予溶媒、S037 0.6 mg/kg、2 mg/kg、10 mg/kg 或 Kadcyla 10 mg/kg(5 只/性别/组);以5 mL/kg容量和2 mL/min恒速连续静脉输注8个周期(每3周给药1次为1个给药周期),停药恢复6周。评价指标包括临床观察、体重、摄食情况、体温、眼科检查、心电图,血液常规、血清生化、血清电解质、凝血四项常规、尿液常规,以及大体解剖肉眼观察、脏器重量及其系数(脏体、脏脑)、组织病理学和骨髓涂片检查,并伴随毒代动力学试验、免疫原性和免疫毒性试验、安全药理试验及局部刺激性试验。结果:测定食蟹猴血清中S037和KadcylaTM总抗体和偶联抗体含量的分析方法标准曲线范围为1.25～80.0 ng/mL,最小稀释度1/100,定量范围为125～8000 ng/mL。6个分析批标准曲线样品吸光值及主要参数的相对标准偏差均不超过12.9%;偶联抗体不超过16.1%。基质50倍以上的稀释不影响S037的测定,将最小稀释度设为1/100。食蟹猴空白血清满足选择性要求。食蟹猴血清中S037总抗体批内和批间准确度在86.6%～111%之间,批内和批间精密度≤13.1%,总误差≤13.9%;偶联抗体批内和批间准确度在87.8%～106%之间,批内和批间精密度≤11.8%,总误差≤12.7%。受试药和上市药物对方法的响应满足分析方法学可比性要求。食蟹猴血清中含不同浓度IgG的空白样品总抗体和偶联抗体测定值均低于定量下限,含不同浓度人IgG的LLOQ、ULOQ样品总抗体准确度(AR%)均值分别在109%～110%、106%～108%;偶联抗体准确度(AR%)均值分别在82.5%～89.7%、103%～104%。1%食蟹猴血清中稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000倍样品的总抗体平均回收率分别为104%、103%、98.2%、104%、102%、107%;偶联抗体平均回收率分别为 92.0%、100%、98.8%、100%、100%、101%。1%食蟹猴血清中总抗体和偶联抗体胡克效应样品的吸光值均大于ULOQ的吸光值且无下降趋势。4个食蟹猴个人给药后血清样品各稀释倍数总抗体汇算浓度的%CV≤3.62%,抗体汇算浓度的%CV≤4.29%。食蟹猴血清配制的稳定性样本的总抗体实测浓度在配制浓度的89.3%～115%;偶联抗体实测浓度在配制浓度的80.9～112%。1%食蟹猴血清配制的稳定性样本的总抗体实测浓度在配制浓度的91.3%～110%;偶联抗体实测浓度在配制浓度的96.7%～111%。2/3以上样本再测值在原测值的±30%以内。食蟹猴血清中的抗药抗体测定的分析方法学验证:选用18例未给药食蟹猴血清用于筛选试验Cutpoint和确认试验Cutpoint值的确立和精密度验证。通过筛选试验中获得S037和Kadcyla的浮动Cutpoint的校正因子分别为1.074和1.104,用于计算每个分析批的Cutpoint值;确认试验中S037和Kadcyla的Cutpoint值(CCP,%)分别为18.4和21.5;精密度试验中质控批内及批间CV(%)均小于20%;S037检测灵敏度为39.1 ng/mL,Kadcyla检测灵敏度为44.7 ng/mL;选择性试验选取10个正常阴性食蟹猴血清进行试验,结果HPC、LPC、NC满足HPC>LPC>NC,且80%的个体NC样品低于或等于CP,阳性质控样品的检测结果为阳性;药物耐受试验中,在LPC水平时,至少能耐受血清样品中30 μg/mL S037或Kadcyla的干扰;S037及Kadcyla的hook效应试验,均未见Hook效应产生;质控样品稳定性(室温及2～8℃放置24 h、室温反复冻融5次、-20℃放置1个月及-80℃放置6个月)满足免疫原性研究的要求。S037食蟹猴静脉输注8周期毒代动力学结果显示:溶媒对照组各给药周期三种被检测物(总抗体、偶联抗体、DM1)浓度均为BLQ。S037各剂量组和Kadcyla对照组三种被检测物的暴露水平均未见明显性别差异。第1周期给药后,S037各剂量组总抗体、偶联抗体和DM1的AUC0-t比值分别为1:6.88:29.5、1:5.87:21.5和1:13.2:79.5,暴露量增加比例均明显高于剂量增加比例(剂量比为1:3:10),呈非线性毒代动力学特征;其余周期呈现类似特征;10 mg/kg等剂量条件下,S037的毒代动力学特征及暴露水平与Kadcyla对照组相当。重复给药8周期,S037各剂量组三种被检测物暴露水平随给药次数的增加有一定的增加趋势,未见明显蓄积;10 mg/kg等剂量条件下,S037和Kadcyla在食蟹猴体内暴露水平相当。本试验中,S0370.6 mg/kg组、S037 2 mg/kg组和Kadcyla 10 mg/kg组在给药后(c4至恢复结束)产生不同水平的ADA(5/10、1/10和1/10);结合TK数据分析,产生较高滴度ADA的部分动物(S037 0.6 mg/kg组2102#、2104#)在第5～8周期给药后血药浓度低于该组其他动物,并有多个时间点的血药浓度为BLQ,提示部分ADA阳性的动物对其毒代动力学产生影响,但其余ADA阳性的动物,则未见对毒代动力学产生明显影响。此外,采用经验证的Cell-based方法(HER2高表达人乳腺癌BT-474)对ADA阳性样本进行了中和活性检测,结果表明S037(0.6 mg/kg)给药后部分动物产生的ADA在较高滴度时具有不同程度的中和活性,其中2104#动物在4个时间点的ADA样本均检测到了较强的中和活性;Kadcyla(10 mg/kg)给药后产生的ADA也具有一定程度的中和活性。在此物质基础条件下,S037食蟹猴静脉输注8周期,S037低剂量组0.6 mg/kg雄性(1104#)食蟹猴c2、c3、c4给药后可见稀便、红色便,并于c4-d11、c4-d12可见呼吸微弱或暂停、张口呼吸和站立不稳等症状,因此于c4-d12执行安乐死;大体解剖可见胸腔积液和急性心包膜炎等组织病理学改变,结合临床观察、临床病理、毒代暴露量、ADA检测结果以及中、高剂量组动物的毒性表现和耐受情况,考虑为非药物相关性死亡。其余动物未见死亡,主要的毒性反应总结如下:S037 高剂量组 10 mg/kg、Kadcyla 对照组 10 mg/kg 可见稀便(3/10、3/10)、皮肤红斑(7/10、5/10)、皮肤潮红(1/10、1/10)、皮肤损伤(2/10、1/10)、皮肤破溃(0/10、1/10)。S037 10 mg/kg 组于 w7、w10、w11、w13、w16、w19、w20 可见摄食情况差,但体重及体重变化均未见明显异常;此外,还可见1302#呕吐、脱毛、活动减少、蜷缩成团,1304#牙龈出血、牙龈红肿、皮屑、发疹。S037高剂量组10 mg/kg、Kadcyla对照组10 mg/kg给药相关的血液常规指标(主要为PLT、PCT、MONO#)改变主要发生在每个给药周期的第5天,可见周期性降低(PLT、PCT)或升高(MONO#),且2组变化程度相当,并于每个给药周期的第21天恢复正常水平。血清生化指标改变主要在每个给药周期的第5天,ALT、AST、ALP、CK可见周期性升高,并于每个给药周期的第21天恢复正常水平;从升高幅度来看,KadcylaTM对照组升高幅度略高于S037高剂量组10 mg/kg。另外,两组在c4-d5、c8-d5均可见TP↑、GLO↑、A/G↓,免疫毒性检测结果显示IgG↑。两组凝血常规指标在c4-d5、c8-d5可见APTTT、TT↑、FIB浓度↑、FIB↓,程度相当。组织病理学均可见肝脏单个枯否氏细胞有丝分裂象增多(6/6、6/6)、单个枯否氏细胞肥大(6/6、6/6)、被膜下肝窦淤血(4/6、1/6),脾脏红髓组织细胞有丝分裂象增多坏死(6/6、5/6),胸腺淋巴细胞减少(6/6、5/6),乳腺腺泡上皮细胞有丝分裂象增多、凋亡增多(4/5、4/5),精囊腺腺泡上皮细胞有丝分裂象增多、凋亡增多(2/3、3/3),胸骨骨髓造血细胞减少(6/6、5/6),坐骨神经轴突变性(3/6、2/6)。骨髓涂片检查均可见骨髓细胞计数粒系升高、淋巴细胞降低。S037中剂量组2 mg/kg临床观察可见稀便2/10、皮肤红斑6/10、发疹1/10、结痂1/10、外伤1/10、皮肤破溃1/10;血液常规及血清生化指标每个给药周期d5可见PCT↓、ALT↑、AST↑,各周期变化趋势与S037高剂量组10mg/kg相同。组织病理学可见肝脏单个枯否氏细胞肥大(1/6),胸腺淋巴细胞减少(1/6),乳腺腺泡上皮细胞有丝分裂象增多、凋亡增多(1/5),精囊腺腺泡上皮细胞有丝分裂象增多、凋亡增多(1/3)。与溶媒对照组相比,S037低剂量组0.6 mg/kg未见药物相关性毒性改变。停药恢复6周,上述血液系统、脾脏、胸腺、肝脏、乳腺、精囊腺、骨髓、坐骨神经等毒性反应均可见恢复或呈明显恢复趋势(胸腺)。结论:测定食蟹猴血清中S037的方法和免疫原性检测方法均已进行验证,可用于本试验。在本试验条件下,S037食蟹猴静脉输注8周期重复给药毒性试验,NOAEL(未见毒性反应剂量)为0.6 mg/kg(第8周期总抗体、偶联抗体和DM1的暴露量AUC0-t 分别为 1135±342 h·μg/mL、854±168 h·μg/mL 和 11.3±10.6 h·ng/mL);HNSTD(最高非严重毒性反应剂量)为10 mg/kg(第8周期总抗体、偶联抗体和DM1的暴露量 AUC0-t 分别为 36220±15200 h·μg/mL、16740±2225 h·μg/mL 和 601±149 h ng/mL);主要表现为血液系统、脾脏、胸腺、肝脏、乳腺、精囊腺、骨髓、坐骨神经的毒性反应。10 mg/kg等剂量条件下,S037与KadcylaTM(第8周期总抗体、偶联抗体和DM1暴露量 AUC0-t分别为 41550±19620 h·μg/mL、20460±3817 h·μg/mL 和 622±265 h-ng/mL)在食蟹猴体内暴露水平相当、毒性表现相似。