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前言核因子（nuclear factor-kappa B,NF-κB）是普遍存在于真核细胞中的转录调节因子。正常状态下,它与抑制蛋白（inhibitor protein,IκB）在细胞浆中结合。当应激反应发生时,IκB磷酸化并被蛋白酶体识别降解,NF-κB被释放,进入细胞核,与特异的κB序列结合,诱导或上调多耐药基因（mdr1基因）的表达,其产生的P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是ATP依赖性的药物泵,可将进入细胞内的药物泵出细胞,使细胞内药物浓度下降,从而出现耐药。硼替佐米（PS-341）是蛋白酶体抑制剂类抗肿瘤药物,临床主要用于复发及难治性多发性骨髓瘤的治疗,在白血病治疗方面的应用仍处于理论研究和探索阶段。本研究采用体外实验的方法观察PS-341对柔红霉素（daunorubicin,DNR）诱导的K562/DNR细胞株NF-κB、IκB及P-gp表达的影响,探讨PS-341逆转耐药的分子机制和作用特点,为临床克服白血病多药耐药提供实验依据。实验材料一、实验对象人白血病多药耐药细胞株K562/DNR由中国医科大学附属第一医院肿瘤内科实验室友情提供。该细胞株由浓度为0.5mmol/L DNR刺激而成,并维持其耐药活性。二、主要仪器和试剂1、MTT法检测细胞耐药性相关试剂2、兔抗人NF-κB、IκB及P-gp一抗（美国SANTA CRUZ公司）3、碱性磷酸酶标记的山羊抗兔和马抗小鼠二抗（北京中山公司）4、鼠抗β-actin（美国Sigma公司）5、NF-κB活性试剂盒（美国Active Motif公司）6、流式细胞仪细胞凋亡检测试剂盒（北京宝赛）7、PS-341（西安杨森公司）实验方法一、细胞培养K562/S、K562/DNR细胞使用含有12%胎牛血清、100U/ml的青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI1640培养液,在37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养。二、MTT法进行耐药细胞株的判定实验分组:K562/S和K562/DNR组;将细胞质量浓度调整为2×105/mL,在96孔板上接种,每个质量浓度设5个平行孔。72h后,每孔加入MTT（5g/L）20μL,继续培养4h,离心弃上清,加二甲基亚砜（DMSO）150μL终止反应,避光振荡15min,用全自动酶标仪检测波长570nm吸光度（A）值,计算生长抑制率和耐药倍数。三、MTT法分析测定PS-341的直接细胞毒活性具体方法同上,每孔加入不同浓度的PS-341 0.4μg/L、4μg/L及40μg/L,以空白对照组的吸光度值作为100%生存率,各浓度组的相对生存率（%）=每实验组吸光值/空白组吸光值×100%。通过计算求得90%生存率时的PS-341剂量即IC10。选取低于IC10的一个浓度作为PS-341逆转耐药的实验浓度。四、Western blot检测各组细胞NF-κB、IκB及P-gp表达情况以100μg/ml DNR单用或联合应用0.4μg/L、4μg/L及40μg/L PS-341作用于K562耐药细胞株36h,以100μg/ml DNR单用或联合应用4μg/L PS-341作用于K562耐药细胞株12h、24h和36h。取各组1×107细胞,加入反应体系,提取细胞的总蛋白并经Larry法定量,取50μg蛋白上样到15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶,电泳。印迹转膜后,用抗NF-κB、IκB及P-gp抗体和抗β-actin抗体孵育,最后加入相应二抗,用显色剂进行显色后用凝胶成像仪分析图像。五、ELISA法进行NF-κB活性检测核蛋白提取方法及实验操作步骤按试剂盒（Activemotif公司产品）说明进行。六、流式细胞仪检测细胞凋亡率分别收集各组的细胞,Annexin-V-FITC双染色,流式细胞仪检测,计算凋亡百分数,记录、储存和分析结果。七、统计方法所有指标以均数加减标准差表示。用SPSS11.5软件进行方差分析和各组间率的比较。P＜0.05认为差别有显著性。实验结果1、DNR对K562/S组细胞的IC50值为1.16μg/mL,对K562/DNR组细胞的IC50值为50.43μg/mL,耐药倍数为43.47。2、PS-341作用于K562/DNR细胞株的IC10为4μg/L。即当PS-341浓度低于4μg/L时,90%细胞存活,可认为此浓度的PS-341本身无直接细胞毒作用。3、与阴性对照组相比,DNR可诱导NF-κB表达上调、活性增强,IκB表达下调,P-gp表达上调;4、加用PS-341可显著抑制DNR诱导的NF-κB及P-gp表达,降低NF-κB活性,其作用呈浓度和时间依赖性。5、与对照组相比,DNR组、40μg/L PS-341组及DNR联合应用不同浓度PS-341组,细胞凋亡率明显增加,而0.4μg/L PS-341组及4μg/L PS-341组细胞凋亡率变化不明显;与DNR处理组相比,加入PS-341后可提高DNR引起的细胞凋亡率,且随PS-341浓度的增加,细胞凋亡率进一步增加;与40μg/L PS-341组相比,DNR联合40μg/L PS-341后细胞凋亡率增加;与相应DNR组相比,加入PS-341后可提高DNR引起的细胞凋亡率,且随PS-341作用时间的延长,细胞凋亡率进一步增加。结论硼替佐米可减少K562/DNR细胞株NF-κB的活化,降低P-gp表达,逆转细胞耐药,促进细胞凋亡。该作用具有时间和浓度依赖性。