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研究背景:支气管哮喘是严重影响人们健康的常见慢性疾病之一,其病理变化为:气道炎症、气道重塑和气道高反应。目前支气管哮喘的治疗仍以缓解症状和控制炎症为主。糖皮质激素仍是目前治疗哮喘的最有效的药物。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases,HDACs）是维持染色体基本单位核小体中组蛋白乙酰化平衡的关键酶之一,与细胞内诸多生命过程密切相关,如炎症基因转录、DNA损伤修复、细胞增殖与凋亡、组织纤维化等。本课题组在前期研究工作中,通过建立急性及慢性OVA哮喘小鼠模型,证实广谱HDAC抑制剂（Givinostat）、HDAC6抑制剂（Tubastatin A Hcl）和HDAC8抑制剂（PCI-34051）可缓解慢性哮喘小鼠的气道炎症、气道高反应和气道重塑,对支气管哮喘小鼠有治疗作用。其中,HDAC8抑制剂在哮喘中,抗炎作用明显优于广谱HDAC抑制剂及HDAC6抑制剂,表现为在哮喘中,HDAC8抑制剂能更好的缓解气道炎症及气道高反应性。巨噬细胞在不同环境下可以分别极化为经典活化型巨噬细胞（M1型）及替代活化型巨噬细胞（M2型）。研究表明,巨噬细胞M2型极化在哮喘的发病过程中起着重要作用。半乳凝集素3（Galectin-3）参与许多炎症反应的进程,在M2型巨噬细胞极化过程中起着重要作用。研究目的:研究HDAC8特异性抑制剂PCI-34051对急性期哮喘小鼠体内巨噬细胞M2型极化的作用,并通过体外实验对其可能的作用机制进行研究。研究方法:本次研究分为三部分,第一部分研究PCI-34051对于急性期哮喘小鼠肺组织内巨噬细胞M2型极化的影响。第二部分通过PCI-34051干预急性期哮喘小鼠,评估PCI-34051对于Galecitn-3的作用及可能作用机制。第三部分选取小鼠腹腔巨噬细胞Raw264.7,通过体外模拟M2型巨噬细胞极化,探讨PCI-34051对于Galecitn-3的作用及PCI-34051对巨噬细胞M2型极化的作用机制。1、HDAC8特异性的抑制剂PCI-34051对急性期哮喘小鼠肺组织内巨噬细胞M2型极化的影响1.1动物模型的分组:选取6-8周SPF级BALB/C雌性小鼠24只,随机数字表法分为正常组（NS组）,哮喘组（OVA组）,布地奈德激素组（OVA/BUD组）,PCI-34051组（OVA/PCI组）。于实验0、7、14天,OVA组,OVA/BUD组及OVA/PCI组小鼠予以致敏液（OVA+Al（OH）3）腹腔注射。末次致敏1周后,于第21-27天使用超声雾化器进行激发液（2%OVA）连续雾化7天,每天一次,30min/次。BUD组使用布地奈德（0.04mg/ml,雾化）,PCI组使用PCI-34051（0.5mg/kg,灌胃口服）,分别于每次激发试验前30min给药。正常组以生理盐水代替OVA及药物。1.2肺功能激发试验:末次激发实验24h之后,采用整体体积描记法检测各组小鼠的气道增强呼气间歇值（Penh）。1.3肺泡灌洗液（BALF）中细胞计数及分类计数:收集小鼠BALF,离心收取沉淀细胞,重悬细胞后进行瑞士-吉姆萨染色,计数BALF中炎症细胞总数及分类细胞数。1.4 ELISA检测:小鼠眼球取血,离心获得血清后,酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中IL-4、IFN-γ及IgE表达水平。1.5病理标本制备及染色:提取小鼠左侧肺组织,石蜡包埋并切片后,对小鼠左侧肺组织切片行HE染色,AB-PAS染色,观察各组小鼠肺组织内炎症细胞浸润及气道粘液分泌。1.6流式细胞术:提取小鼠肺组织单细胞悬液,通过流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞表型F4/80,M1型标记物CD86,M2型标记物CD206的表达。1.7免疫组织化学:采用SABC法,对小鼠左侧肺组织切片进行染色,检测CD68,CD86,CD163,iNOS在肺组织内表达。1.8 Q-PCR:提取各组小鼠肺组织mRNA,检测肺组织内Arg1 mRNA,iNOS mRNA水平。1.9 Western Blot:提取各组小鼠肺组织蛋白,检测肺组织内Arg1,i NOS表达水平。2、PCI-34051对急性期哮喘小鼠肺组织内Galecitn-3的作用2.1动物模型的制备和分组:6-8周SPF级BALB/C雌性小鼠,随机数字表法分为正常组（NS组）,哮喘组（OVA组）,布地奈德激素组（OVA/BUD组）,PCI-34051组（OVA/PCI组）。造模方法如前。2.2免疫组织化学:采用SABC法,对小鼠左侧肺组织切片进行染色,检测Galectin-3,HDAC8在肺组织内定位。2.3 Western Blot:提取各组小鼠肺组织蛋白,检测肺组织内Galectin-3,HDAC8表达水平。2.4免疫荧光双染技术:对小鼠左侧肺组织切片进行免疫荧光双染,检测小鼠肺组织内Galectin-3,HDAC8表达位置。3、PCI-34051对于Raw264.7细胞M2型极化的作用及作用机制3.1细胞培养:将小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7加入到含有10%胎牛血清并且不含内毒素的DMED高糖液体培养基中进行培养;细胞均放置于5%CO2,37℃的培养条件下进行培养。3.2细胞处理及分组:常规传代培养,培养基采用含10%胎牛血清的DMEM高糖。分为Con组,IL-4组及IL-4/PCI组。Con组正常培养,IL-4组用重组IL-4蛋白（R&D Systems）刺激巨噬细胞,（浓度为20ng/ml）,IL-4/PCI组先用PCI-34051（浓度为10μM）刺激巨噬细胞后,再使用重组IL-4蛋白（浓度为20ng/ml）刺激巨噬细胞。3.3 Q-PCR检测:提取各组细胞mRNA,检测细胞内Arg1 mRNA,iNOS mRNA水平。3.4 Western Blot:提取各组细胞内蛋白,检测细胞内Arg1,iNOS,Galectin-3,HDAC8表达水平。3.5免疫荧光双染技术:对各组细胞进行免疫荧光双染,检测巨噬细胞内Galectin-3,HDAC8表达位置。3.6通过shRNA技术干扰Galectin-3的表达,Western Blot检测Galectin-3沉默后,IL-4诱导后Arg1蛋白表达水平。3.7通过免疫共沉淀试验（Co-IP）检测各组细胞HDAC8及Galecitn-3蛋白之间的作用。研究结果:1、HDAC8特异性的抑制剂PCI-34051对急性期哮喘小鼠肺组织内巨噬细胞M2型极化的影响1.1与OVA组相比,OVA/BUD组及OVA/PCI组肺组织内及气道周围炎性细胞浸润及粘液分泌均明显减轻,气道高反应明显减轻;1.2与OVA组相比,OVA/BUD组及OVA/PCI组中,小鼠血清内IL-4及IgE明显减低。1.3与OVA组相比,OVA/BUD组及OVA/PCI组BALF中炎症细胞总数及巨噬细胞数量明显降低。1.4流式细胞术结果显示,与NS组相比,OVA组小鼠肺组织内M2型巨噬细胞极化水平CD206/F4-80表达明显增加,而OVA/BUD组及OVA/PCI组水平降低。1.5免疫组化结果显示,与NS组相比,OVA组小鼠肺组织内CD163明显增多,而CD86轻度增加。布地奈德及PCI-34051干预后,急性期哮喘小鼠肺组织内CD163明显降低。1.6 Q-PCR结果表明,与NS组相比,OVA组小鼠肺组织内M2型巨噬细胞标志物Arg1 mRNA明显增加,而OVA/BUD组及OVA/PCI组Arg1 mRNA明显降低。1.7 Western Blot结果表明,与NS组相比,OVA组小鼠肺组织内M2型巨噬细胞标志物Arg1蛋白水平明显增加,而OVA/BUD组及OVA/PCI组Arg1蛋白水平明显降低。2、PCI-34051对急性期哮喘小鼠肺组织内Galecitn-3的作用2.1免疫组化结果显示,与NS组相比,OVA组小鼠肺组织内Galectin-3明显增多,而OVA/BUD组及OVA/PCI组小鼠肺组织内Galectin-3表达明显降低。在OVA组小鼠肺组织内,HDAC8明显增多,而OVA/BUD组及OVA/PCI组小鼠肺组织内HDAC8表达明显降低。2.2 Western Blot显示,与OVA组小鼠相比,OVA/BUD组与OVA/PCI组小鼠肺组织内Galectin-3及HDAC8蛋白表达均明显降低。2.3免疫荧光结果表明,在NS组中,Galectin-3及HDAC8无明显共表达。而在OVA组中,部分Galecitn-3出现细胞核内表达,且HDAC8出现共表达。而OVA/BUD组及OVA/PCI组中,Galectin-3及HDAC8共表达明显就减少。3、PCI-34051对于Raw264.7细胞M2型极化的作用及作用机制3.1 Q-PCR结果显示,与Con组相比,IL-4促进Arg1 mRNA的表达,抑制iNOS mRNA的表达。与IL-4组相比,IL-4/PCI组抑制Arg1 mRNA的表达。3.2 Western Blot结果显示,PCI-34051抑制由IL-4诱导的HDAC8及Galecitn-3表达的增加。3.3 Galectin-3沉默后,IL-4刺激引起的Arg1蛋白表达明显降低。3.4免疫荧光结果显示,IL-4刺激之后,Galecitn-3在细胞质及细胞核内均表达,且HDAC8及Galecitn-3的共表达明显增多。而PCI-34051不仅抑制Galectin-3及HDAC8的表达,同时抑制其共表达。3.5免疫共沉淀（Co-IP）结果显示,与Con组相比,IL-4组中Galectin-3与HDAC8之间的相互作用明显增加。而PCI-34051处理后,Galectin-3与HDAC8之间的相互作用明显降低。研究结论:1.HDAC8特异性抑制剂PCI-34051可以抑制急性期哮喘小鼠的气道炎症及气道高反应。2.PCI-34051可以抑制急性期哮喘小鼠体内巨噬细胞的M2型极化。3.布地奈德可以同时抑制急性期哮喘小鼠体内巨噬细胞的M1型M2型极化,而PCI-34051仅可以抑制急性期哮喘小鼠体内巨噬细胞的M2型极化,且其效果与布地奈德相当。4.Galectin-3在巨噬细胞M2型极化过程中起着重要作用。5.PCI-34051可以通过抑制Galectin-3及HDAC8之间的相互作用抑制巨噬细胞的M2型极化。