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1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种以分泌胰岛素的胰岛β细胞特异性损伤为特征的自身免疫性疾病。研究已经表明，CD4+和CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞等均参与了对胰岛β细胞的破坏，而且凋亡是胰岛β细胞主要的死亡形式。T1DM的发病机制十分复杂，虽然目前仍不十分清楚，但越来越多的证据显示，Th1细胞及其细胞因子是导致胰岛β细胞的破坏的重要原因，而使免疫平衡向Th2方向偏移能够延缓甚至预防T1DM的发病。此外，CD4+CD25+调节性T细胞在维持机体外周免疫耐受中发挥着十分重要的作用，诱导CD4+CD25+调节性T细胞的产生可以有效地预防和治疗T1DM。研究发现，在T1DM患者发展成为显性糖尿病之前存在一个相对较长的临床前期，在此期进行有效的免疫干预有可能延缓甚至预防糖尿病的发生发展。因此，T1DM早期有效的干预方式已越来越受到人们的关注。机体重建对胰岛素自身抗原的免疫耐受是预防和治疗T1DM的重要手段之一，在目前报道的胰岛自身抗原中，谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）65被认为是T1DM发生发展的关键抗原，而且研究显示GAD65能够通过诱导免疫耐受或者其他的机制，减轻胰岛炎，预防T1DM。DNA疫苗由于其具有安全性高、制备简单经济、易于储存运输等特点，近年来已经在感染性疾病和肿瘤的预防中取得了较好的疗效。目前已有运用编码自身抗原GAD65的DNA疫苗对T1DM预防研究的报道，但是结果很不一致，甚至出现相反的结论。我们以前的研究结果也证明，编码人全长GAD65基因的DNA疫苗来说仅使人类T1DM理想的动物模型——非肥胖糖尿病（non-obese diabetic，NOD）鼠糖尿病的发病率降低30％左右，预防效果尚不理想，还有许多可以改进之处。综上所述，本研究的目的在于：优化我们以前构建的编码全长GAD65基因的DNA疫苗，并对NOD鼠进行预防，进一步探讨其可能的机制，旨在为人类T1DM的预防进一步奠定实验基础。本研究共分为三个部分：1．通过改良抗原基因序列、与细胞因子基因或其他胰岛自身抗原基因共表达的方法，构建和鉴定8种新的GAD65片段DNA疫苗，并在检测其表达。2．将构建好的8种GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠进行预防实验，观察不同GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠糖尿病发病和胰岛炎的作用。3．检测几种有效的GAD65片段DNA疫苗免疫对NOD鼠胰岛p细胞凋亡、免疫耐受、Th1／Th1免疫平衡、以及CD4+CD25+调节性T细胞的作用，探讨不同GAD65片段DNA疫苗预防NOD鼠糖尿病可能的作用机制。第一部分GAD65片段DNA疫苗的构建、鉴定与优化目的构建、鉴定和优化以预防1型糖尿病为目的的编码不同谷氨酸脱羧酶（GAD）65基因片段的DNA疫苗。方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-315（GAD1）片段和GAD490-570（GAD2）片段的cDNA，以ovedap PCR法将之分别与IL-2信号肽cDNA拼接，得到带信号肽的SGAD1、SGAD2融合基因。并分别以IL-4、IL-10及胰岛原质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-4、IL-10和胰岛素B链（InsB）基因。SGAD1、SGAD2、IL-4、IL-10和InsB基因先克隆入pGEM-T载体后，先将SGAD1、SGAD2融合基因分别克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种单基因重组真核表达载体pBud-SGAD1和pBud-SGAD2，再分别将IL-4、IL-10、InsB基因克隆入真核表达载体pBud-SGAD1和pBud-SGAD2中，构建出pBud-SGAD1／IL-4、pBud-SGAD1／IL-10、pBud-SGAD1／InsB、pBud-SGAD2／IL-4、pBud-SGAD2／IL-10、pBud-SGAD2／InsB6种双基因重组真核表达载体。重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法体外转染COS-7细胞，转染后以蛋白质印迹法检测SGAD1、SGAD2及InsB的表达，ELISA方法检测细胞因子IL-4和IL-10的表达。结果（1）核酸序列测定表明克隆的SGAD1、SGAD2融合基因、IL-4、IL-10和InsB基因序列与报告序列一致，开放读码框正确。（2）蛋白质印迹法检测到SGAD1、SGAD2和InsB在COS-7细胞中的表达，其中融合蛋白SGAD1和SGAD2可以分泌表达。（3） ELISA方法检测到细胞因子IL-4和IL-10在COS-7细胞中的表达。结论首次成功构建了pBud-SGAD1、pBud-SGAD2、pBud-SGAD1／IL-4、pBud-SGAD1／IL-10、pBud-SGAD1／InsB、pBud-SGAD2／IL-4、pBud-SGAD2／IL-10、pBud-SGAD2／InsB8种新的GAD65片段DNA疫苗，为1型糖尿病的DNA疫苗预防研究提供了实验基础。第二部分GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠糖尿病和胰岛炎的作用目的探讨优化后的GAD65片段DNA疫苗对NOD鼠糖尿病发病和胰岛炎的作用。方法3-4周龄NOD雌鼠随机分为PBS组（n=20）、pBudCE组（n=18）、GAD65组（n=18）、SGAD1组（n=17）、SGAD2组（n=18）、SGAD1／IL-4组（n=19）、SGAD1／IL-10组（n=17）、SGAD1／InsB组（n=20）、SGAD2／IL-4组（n=18）、SGAD2／IL-10组（n=17）和SGAD2／InsB组（n=19）11个组，分别肌肉注射PBS、pBudCE空质粒、pcDNA3.1（+）／GAD65 DNA疫苗和经过优化后的pBud-SGAD1、pBud-SGAD1／IL-4、pBud-SGAD1／IL-10、pBud-SGAD1／InsB、pBud-SGAD1、pBud-SGAD2／IL-4、pBud-SGAD2／IL-10、pBud-SGAD2／InsB DNA疫苗，注射量为75μg，一周后重复一次，两次共150μg。自10周龄开始，每周测尿糖一次，尿糖阳性后监测血糖，连续两次血糖≥16.7mmol／L即诊断为糖尿病，所有动物观察至发生糖尿病或者至30周龄。各组再取6-8只12周龄未发病小鼠胰腺HE染色观察胰岛炎情况。结果（1）与PBS组相比，SGAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组NOD鼠糖尿病的发病明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。（2）无论与GAD65组相比，还是与SGAD1组相比，SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组NOD鼠糖尿病的发病明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。（3）与PBS组相比，pBudCE、SGAD1／InsB、SGAD2、SGAD2／IL-4、SGAD2／IL-10和SGAD2／InsB组NOD鼠糖尿病的发病差异无显著性。（5） 12周龄时，无论与PBS组或与GAD65组相比，pBud-SGAD1、pBud-SGAD1／IL-4、pBud-SGAD1／IL-10 DNA疫苗能够降低NOD鼠胰岛炎的严重程度（P＜0.05或P＜0.01）。结论pBud-SGAD1、pBud-SGAD1／IL-4、pBud-SGAD1／IL-10DNA疫苗减轻胰岛炎和预防NOD鼠糖尿病的疗效优于pcDNA3.1（+）／GAD65 DNA疫苗，其中pBud-SGAD1／IL-4和pBud-SGAD1／IL-10 DNA疫苗的疗效更好。第三部分GAD65片段DNA疫苗预防NOD鼠糖尿病的机制探讨目的探讨优选的GAD65片段DNA疫苗预防NOD鼠胰岛炎和糖尿病的机制。方法PBS组、pBudCE组、GAD65组、SGAD1组、SGAD1／IL-4组、SGAD1／IL-10组各取6-8只12周龄未发病NOD雌鼠并处死，TUNEL加SP免疫组织化学方法检测胰岛β细胞的凋亡情况；制备脾细胞悬液后，[3H]掺入法检测脾细胞对特异性抗原GAD65的刺激增殖反应；流式细胞仪检测脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的数量；ELISA方法测定抗原刺激后脾细胞培养上清中Th1细胞因子IFN-γ，Th2细胞因子IL-4、IL-10水平；RT-PCR方法检测脾脏内细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和转录因子foxp3 mRNA的表达。结果（1） SGAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组NOD鼠胰岛β细胞凋亡率均低于PBS组（均P＜0.05）。（2） GAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组NOD鼠脾细胞特异性抗原刺激增殖反应低于PBS组（均P＜0.01）。（3） SGAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组脾细胞培养上清中IFN-γ水平均低于PBS组（均P＜0.01）和GAD65组（均P＜0.01）；SGAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组脾脏中IFN-γmRNA表达水平也均低于PBS组（均P＜0.01）和GAD65组（均P＜0.01）。（4） SGAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组脾细胞培养上清中IL-4水平均高于PBS组（P＜0.05或P＜0.01），SGAD1／IL-4组的IL4水平高于GAD65组（P＜0.05）GAD1、SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组脾脏中IL-4 mRNA表达水平高于PBS组（P＜0.05或P＜0.01）和GAD65组（P＜0.05或P＜0.01）。（5） SGAD1／IL-10组脾细胞培养上清中IL-10水平高于PBS组（P＜0.05）和GAD65组（P＜0.05）；SGAD1／IL-4和SGAD1／IL-10组脾脏中IL-10 mRNA表达水平高于PBS组（P＜0.05或P＜0.01）和GAD65组（P＜0.05）。（6）各组间NOD鼠脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的数量，以及脾脏中Foxp3 mRNA表达水平差异无显著性。结论pBud-SGAD1、pBud-SGAD1／IL-4、pBud-SGAD1／IL-10DNA疫苗免疫NOD鼠后，下调Th1细胞因子IFN-γ，上调Th2细胞因子IL-4和IL-10，导致免疫平衡向Th2方向偏移，使NOD鼠胰岛炎减轻，胰岛β细胞凋亡减少，并诱导NOD鼠对自身抗原GAD65的免疫耐受，从而预防NOD鼠发生糖尿病。