灯盏乙素苷元和二氢杨梅素对人CD3+T淋巴细胞的作用研究和其脂质体剂型的初步研究

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灯盏花素(breviscapine),是从菊科植物灯盏细辛(Erigeron breviscapu)当中提取的黄酮类的有效成分,结构式鉴定是黄酮-7-葡萄糖醛酸甙,又名野黄芩苷[1,2]。灯盏乙素苷元(Scutellarein,SCU,又名野黄芩素),化学名称为5,6,7,4’-四羟基黄酮,与灯盏乙素的化学结构区别在灯盏乙素苷元(SCU)是灯盏乙素脱去葡萄糖醛酸基团的苷元部分,是灯盏乙素在体内被吸收的主要有效成分形式[3,4],有许多生物学特性,包括神经保护作用、抗炎症效应、金属螯合和自由基清除效应,用于治疗风湿病、哮喘、神经紊乱、炎症。二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)又叫双氢杨梅素、双氢杨梅树皮素等,它也属于黄酮类的化合物,广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物当中,其中藤茶中含量最为丰富,民间常用来治疗感冒、咽喉肿痛、止咳等的治疗作用[5]。现代药理学研究发现二氢杨梅素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管、保护神经系统等多种药理作用,具有很好药理开发潜力[68]。近年来,随着中草药抗炎作用研究地不断深入,大量的研究表明黄酮类化的合物具有抗炎、抗氧化、抑菌和提高免疫力等功效。黄酮类的化合物已经被证明可以很好地抑制NF-k B和COX-2的表达,并且还可以阻断PI3K/Akt和MAPK的信号通路,从而来起到在肿瘤中的抗炎效果。有些研究如Jae Yeon Kim等在体外研究了植物中提取到的3-O-甲基-黄酮的抗炎活性,它们可以抑制可诱导的NO合成酶(i NOS)的活性,从而抑制了NO的产生,达到抗炎目的[9]。最近几年发现黄酮类化合物显著降低JAK-STAT磷酸化水平和STAT的核易位,如杨兆祥等证明5,6,7,4’—四羟基黄酮及其衍生物可作用JAK酪氨酸蛋白酶抑制剂应用[10],同时JAK-STAT信号通路在免疫的免疫细胞的生长分化以及细胞因子的分泌都有重要影响[11]。前期的研究表明了黄酮类化合物中的灯盏乙素苷元(scutellarein,SCU)和二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)对体外诱导扩增的人CD3+T细胞的细胞毒性,凋亡以及细胞因子分泌的影响。对体外用MACS CD3+磁珠分选CD3+T细胞扩增和培养;用凋亡试剂盒检测SCU和DHM对人CD3+T细胞的凋亡作用;用流式细胞仪检测CD3+T细胞CD25和CD69的表达。同时用ELISA检测对CD3+T淋巴细胞分泌细胞因子IL-17A,IL-6,TNF-α,INF-γ的影响。结果发现SCU和DHM明显抑制TNF-α的分泌,在40u M时,TNF-α只有未治疗组的50%左右,但对IL-6,IL-17A,IFN-γ的分泌并无明显影响;同时,CCK-8检测结果显示CD3+T淋巴细胞的细胞存活率依旧高达80%,无明显细胞毒性;凋亡实验也显示在SCU和DHM作用后,CD3+T淋巴细胞的CD25和CD65与对照组并无明显差异,并无明显凋亡现象。黄酮类化合物SCU和DHM能直接抑制CD3+T淋巴细胞分泌炎症因子TNF-α,同时并不会影响CD3+T淋巴细胞的细胞活性和功能活性。后期还对灯盏乙素苷元和二氢杨梅素进行了一些初步的剂型研究,将SCU和DHM制备成长循环脂质体。SCU脂质体采用实验室前期筛选好的处方,脂质体的制备可以提高难溶药物在溶液中的溶解性,结合二种化合物的抗炎作用,以便为以后的进行体内动物实验的给药。所制备的灯盏乙素苷元和二氢杨梅素长循环脂质体储存的稳定性,是否能显著提高灯盏乙素苷元和二氢杨梅素的生物利用度,以及能否延长二者的生物半衰期还需要进一步的研究,但是灯盏乙素苷元和二氢杨梅素长循环脂质体的制备为难溶性化合物脂质体的制备、表征和释放速率控制提供了参考。
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