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研究背景与意义
中国是一个水牛资源极其丰富的国家，基于水牛细胞染色体核型分类，将亚洲水牛分成三种类型：沼泽型(核型2n=48，役用为主)，河流型(核型2n=50，乳用为主)及杂交型(核型2n=49，役用、乳用)。近年来，由于生物化学和现代遗传学技术的发展，人们已开始进行试管水牛和克隆水牛繁殖的研究。开展水牛线粒体基因组结构和功能的研究，对于深入了解水牛发育过程中基因表达与调控的分子机理，核外基因与核内基因遗传信息的相互作用及其与母性遗传性状关系具有重要意义。另外，水牛线粒体基因组序列的测定可以丰富线粒体基因组数据库，为进一步探讨水牛起源和进化提供科学依据。线粒体直接影响ATP的合成，因而必然影响与体内能量代谢密切相关的重要经济性状。牛线粒体F<,0>部分包含ATP6和ATP8两个亚基，但是线虫线粒体基因组不包含ATP合成酶的另一个亚基ATP8基因，这与一般后生动物线粒体基因组有所区别。线粒体基因组分子进化分析亦表明，ATP8基因在哺乳动物线粒体13个编码蛋白质的基因中变异性较大，因此ATP8基因在线粒体能量代谢和细胞发育中的作用需要进一步研究。
目的
选择具有代表性的中国水牛品种(沼泽型水牛)，提取并纯化线粒体DNA，利用同源分析设计引物、PCR扩增水牛线粒体基因组不同区域片段测序，拼接各片段序列，并进一步获得全序列。
分析水牛mtDNA序列基因组成、基因排列和基因结构并与其他已报道物种的线粒体DNA进行比较基因组研究，探讨中国水牛线粒体DNA序列结构特点，进一步进行水牛线粒体DNA分子进化分析。
选择线粒体重要标记基因——ATP8基因，进行RNA干扰研究，探讨其功能。
方法
1．用改进高盐沉淀法，提取水牛线粒体DNA。
2．同源分析法设计多对引物，PCR测序，利用DNASTAR和Chromas2.22软件对测序结果进行序列拼接，拼接后留下的少许空隙，重新设计引物测序，最后得到水牛线粒体全基因组序列。
3．生物信息学软件分析水牛线粒体基因组组成和结构特征。
4．siRNA载体表达法构建线粒体ATP8基因RNA干扰载体。
结果
1．中国水牛线粒体基因组基因组成与结构特点
中国水牛线粒体基因组全序列长度为16359bp，包含13个编码蛋白质的基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和一段100p区序列。
通过序列对比和软件分析推测了水牛线粒体DNA编码的22个tRNA基因序列(包括二个tRNA和二个tRNA)及其二级结构，它们的碱基长度在60～75之间，这些tRNA基因除tRN、tRNA、tRNA(GCU)外都具有折叠成典型三叶草结构特征，包括氨基酸接受臂、二氢尿嘧啶(DHU)臂、反密码子环、TψC环。中国水牛(2n=48)线粒体DNA编码的12S rRNA和16S rRNA进化上高度保守，其中12S rRNA与奶牛(2n=60)或印度水牛(2n=50)的12S rRNA的同源性均为100％。水牛线粒体DNA编码蛋白质的基因序列除ND6在轻链外，其余在重链，包括7个NADH脱氢酶亚基(NADH dehydrogenase subunit)、3个细胞色素C氧化酶亚基(Cytochrome Coxidase subunit)、2个ATP合成酶亚基(ATPsynthase FO subunit)、1个细胞色素6编码基因(Cytochrome 6)。这些编码蛋白质的基因没有内含子，有些与其它基因重叠少许碱基，起始密码子包括AUG、AUA，终止密码子包括UAA、UAG及U。另外，水牛mtDNA中的UGA编码色氨酸，而不是通常的终止密码子，其机制有待进一步阐明，这些蛋白编码基因总长11403bp，占全长的70％。
2．水牛线粒体分子进化分析
中国水牛、印度水牛和奶牛都属于偶蹄目反刍亚目，它们之间蛋白编码基因和氨基酸序列相互差异，在中国水牛和奶牛之间氨基酸差异从0.01％(COXI)到0.11％(ATP8)，平均值为0.06％。中国水牛和印度水牛之间氨基酸差异从0.00％(COYI)到0.04％(ND4L)，平均值为0.02％。COXⅠ、COXⅡ和COX Ⅲ的核苷酸和氨基酸差异较小，而ATP8较大。ATP8分子进化树表明水牛与海豹进化距离较远，与奶牛、绵羊相对较近。
3．ATP8基因RNA干扰载体构建
基于ATP8 RNA二级结构设计合成RNA干扰寡核苷酸序列，重组质粒经过限制性内切酶及测序鉴定，表明了成功构建pGPHl／GFP／Neo-buffalo-shATP8 RNA干扰表达质粒。
结论
1．完成中国水牛线粒体基因组全长测序及组成分析，并通过基因库Genbank审查(NC 006295．1 GI：52220982)。
2．在中国水牛、奶牛、印度水牛之间线粒体13个蛋白编码基因氨基酸序列差异分析中，发现中国水牛与奶牛(不同物种之间)的ATP8基因变异性最高，可作为牛乳制品分子鉴定的重要标记基因。同时，发现水牛不同品种间的ATP8基因变异性也较高，可作为品种筛选的重要标记基因。
3．构建水牛线粒体ATP8基因RNA干扰载体，为转基因线粒体研究、探讨ATP8功能奠定基础。