胃癌是一种严重威胁人类健康的疾病,其在所有恶性肿瘤中的发病率和致死率分列第六位和第二位。尽管近年来,胃癌在预防、诊断和治疗等方面取得了重大进展,但仍有许多问题尚未解决,尤其是胃癌发生发展的免疫学调控机制有待阐明。目前普遍认为,胃癌的发生发展及其预后受肿瘤与宿主免疫系统的相互调控。肥大细胞是胃癌微环境中的重要组成部分。目前的研究主要集中于肥大细胞的浸润程度与患者生存率的相关性分析,以及肥大细胞浸润程度与肿瘤局部血管生成的关系。然而,肥大细胞在胃癌中的分布、免疫调控机制和具体的效应尚不明确。研究目的1.明确肥大细胞在胃癌微环境中浸润情况及相关趋化机制2.阐明胃癌微环境诱导肥大细胞脱颗粒的调控机制及其促瘤效应3.明确胃癌微环境中肥大细胞的表型特征及其调控机制4.阐明肥大细胞通过发挥免疫抑制功能介导胃癌进展的作用机制及其临床意义研究方法1.肥大细胞在胃癌微环境中浸润情况及相关趋化机制从胃癌组织（包括瘤内区、浸润区、癌旁区和非肿瘤正常胃组织区）中分离制备单细胞悬液,流式细胞术检测肥大细胞在不同部位的浸润情况,并用免疫组织化学方法检测肥大细胞在胃癌组织中的分布。在胃癌组织中,检测肥大细胞上的趋化因子受体谱的表达情况。采用流式细胞术分选胃癌中原位肥大细胞,进行趋化实验,阐明肥大细胞在胃癌组织中浸润增多的产生机制。2.胃癌微环境诱导肥大细胞脱颗粒的调控机制及其促瘤效应肿瘤组织培养上清（TTCS）及非肿瘤正常胃组织培养上清（NTCS）刺激人脐带血来源的肥大细胞（hCBMC）1 h,通过β-hexosaminidase的释放水平检测肥大细胞的脱颗粒程度。采用基因芯片筛查胃癌组织中促炎细胞因子表达谱,并用对应的人重组细胞因子刺激肥大细胞系（LAD2细胞）1 h,检测β-hexosaminidase的释放水平。ELISA检测肿瘤或非肿瘤正常胃组织中ADM和β-hexosaminidase的浓度。免疫荧光染色检测ADM和RAPM2在胃癌组织中的表达情况。TTCS刺激肥大细胞,并加入ADM受体拮抗剂AMA（1μM）,检测其在TTCS介导的肥大细胞脱颗粒活动中的抑制作用。信号通路研究中,LAD2细胞用不同的信号通路抑制剂（10μM）预处理2 h,再用TTCS刺激1 h,检测肥大细胞脱颗粒程度。用TTCS刺激LAD2细胞10 min（加或未加AMA）,Western Blot检测LAD2细胞中的AKT和p-AKT的表达水平。体外,用不同的肥大细胞培养上清刺激胃癌细胞系24 h或72 h,用CCK-8或膜联蛋白V、脱氧尿苷三磷酸核苷酸分别检测胃癌细胞增殖或凋亡情况。体内,构建荷瘤小鼠模型,将肥大细胞注射至瘤体内（根据分组,腹腔注射或不注射cromolyn）。每2天记录瘤体生长情况。免疫组织化学染色检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达。TTCS或NTCS刺激hCBMC,收集其上清,检测上清中IL-17A的浓度。体外,用TTCS刺激hCBMC,收集其上清,并加入IL-17A中和抗体（20μg/ml）或同型对照抗体（20μg/ml）,用该上清培养胃癌细胞系24 h或72 h,用CCK-8或膜联蛋白V、脱氧尿苷三磷酸核苷酸分别检测胃癌细胞增殖或凋亡情况。体内,构建荷瘤小鼠模型,将肥大细胞注射到瘤体内。根据分组,每2天腹腔注射IL-17A中和抗体或同型对照抗体。每2天记录瘤体生长情况。免疫组织化学染色检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达。3.胃癌微环境中肥大细胞的表型特征及其调控机制胃癌组织分离制备单细胞悬液,流式细胞术检测组织中浸润的肥大细胞的表型特征。免疫荧光染色检测胃癌中肥大细胞PD-L1的表达。用50%浓度的TTCS或NTCS刺激hCBMC 24 h;用20%、40%、80%浓度的TTCS刺激hCBMC 24 h;用50%浓度的TTCS刺激hCBMC 6、12、24 h,流式细胞术检测hCBMC上PD-L1的表达水平。用不同人重组细胞因子（100 ng/ml）刺激hCBMC 24 h,流式细胞术检测hCBMC上PD-L1的表达水平。ELISA检测肿瘤组织和非肿瘤正常胃组织及其培养上清中TNF-α的浓度。用50%浓度的TTCS（加或不加TNF-α中和抗体）刺激hCBMC 24 h,流式细胞术检测hCBMC上PD-L1的表达水平。信号通路研究中,用信号通路抑制剂对hCBMC预处理,再用TTCS刺激预处理的hCBMC 24 h,流式细胞术检测肥大细胞的表型特征。用TTCS、NTCS及TTCS+anti-TNF-α刺激LAD2细胞或LAD2细胞用BAY11-7082（一种IκBα抑制剂）或DMSO预处理后,再用TTCS刺激,收集LAD2细胞,Western Blot检测细胞中PD-L1、p65、p-p65的表达水平。4.肥大细胞通过发挥免疫抑制功能介导胃癌进展的作用机制及其临床意义分选肿瘤或非肿瘤正常胃组织中原位肥大细胞,在加或不加PD-L1（20μg/ml）中和抗体下,与胃癌患者外周血来源的CFSE标记的CD3⁺T细胞共培养5天。收集细胞进行流式细胞染色,检测T细胞的增殖及γ-干扰素（IFN-γ）的表达情况,并收集细胞共培养上清,ELISA检测上清中T细胞分泌的效应因子浓度。体内,构建荷瘤小鼠模型。TTCS诱导的条件性hCBMC,在加入PD-L1中和抗体（20μg/ml）或同型对照抗体（20μg/ml）下,与CFSE标记的CD3⁺T细胞共培养5天。在荷瘤小鼠瘤体萌出时,将共培养的肥大细胞和T细胞通过腹腔注射到小鼠体内。每2天记录瘤体生长情况。免疫组织化学染色检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达。提取移植瘤组织蛋白,ELISA检测不同处理组的小鼠瘤体中IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B的浓度。分析胃癌中肥大细胞的浸润程度,与患者临床指标、生存率的相关性。研究结果1.肥大细胞在胃癌微环境中浸润情况及相关趋化机制的结果1.1流式细胞术检测肥大细胞在组织不同部位的浸润情况,发现:晚期（III+IV期）胃癌患者瘤内区的肥大细胞占白细胞比例（即肥大细胞百分比）为11.69%±0.65%,其浸润程度显著高于浸润区（5.53%±0.73%）、癌旁区（7.44%±0.42%）和非肿瘤正常组织区（5.68%±0.34%）。免疫组织化学染色得到一致的结果,统计发现:在随机一个低倍镜视野中,晚期胃癌患者瘤内区的类胰蛋白酶阳性肥大细胞数为90±6,其浸润数目显著高于浸润区（39±7）、癌旁区（33±4）和非肿瘤正常组织区（23±3）。1.2瘤内浸润的肥大细胞高表达CXCR4,且其表达水平高于癌旁及非肿瘤正常胃组织中的肥大细胞。肿瘤组织及其组织培养上清（TTCS）中CXCL12的浓度分别为72.64±7.85 pg/mg和547.0±91.41 pg/ml,分别显著高于非肿瘤正常胃组织中CXCL12的浓度（35.11±3.97 pg/mg）及其培养上清（NTCS）中CXCL12的浓度（293.5±36.32pg/ml）。趋化实验中,计数各组趋化到Transwell下室的肥大细胞数目,发现:TTCS和NTCS组中,趋化到下室的肥大细胞数分别为8275±701和4483±295,说明相较于NTCS,TTCS对肥大细胞有更强的趋化作用;在TTCS中加入CXCL12中和抗体及CXCR4中和抗体处理组中,趋化到下室的肥大细胞数目减少,分别为6367±521及5900±529,说明CXCL12中和抗体或CXCR4中和抗体可以拮抗TTCS对肥大细胞的趋化效应。以上结果提示CXCL12-CXCR4轴可介导肥大细胞向肿瘤微环境中募集。2.胃癌微环境诱导肥大细胞脱颗粒的调控机制及其促瘤效应的结果2.1 TTCS与NTCS刺激肥大细胞,其β-hexosaminidase的释放水平分别为34.10%±2.33%和16.07%±1.61%,说明TTCS能够显著诱导肥大细胞发生脱颗粒活动。筛查诱导肥大细胞脱颗粒的物质,发现:ADM可以显著诱导肥大细胞发生脱颗粒,其β-hexosaminidase的释放水平达到27.25%±1.25%（空白对照组为9.17%±0.34%）,且具有浓度依赖关系。当加入ADM受体拮抗剂AMA后,TTCS介导的肥大细胞β-hexosaminidase的释放水平由32.05%±2.02%降至18.86%±1.09%,脱颗粒活动受到显著抑制,表明TTCS中的ADM可诱导肥大细胞脱颗粒。2.2信号通路研究中,TTCS刺激Wortmannin（PI3K信号通路抑制剂）预处理的LAD2细胞,其β-hexosaminidase的释放水平为16.95%±1.59%（DMSO处理组为38.36%±2.42%）,其脱颗粒活动受到显著抑制。TTCS刺激LAD2细胞可以上调细胞中AKT的磷酸化水平;当TTCS中ADM被拮抗后,LAD2细胞中AKT磷酸化水平下调。以上结果提示,胃癌来源的ADM可以激活肥大细胞的PI3K-AKT信号通路,此通路在肥大细胞脱颗粒活动中发挥重要作用。2.3体外,细胞培养发现:相较于NTCS刺激hCBMC的培养上清,TTCS刺激hCBMC的培养上清能更显著地诱导胃癌细胞增殖并抑制其凋亡。体内,构建荷瘤小鼠模型,发现:与只注射肥大细胞的处理组相比,注射了肥大细胞+cromolyn处理组中小鼠肿瘤体积显著缩小且肿瘤细胞增殖能力下降,提示肥大细胞脱颗粒活动具有促瘤效应。2.4多种重组细胞因子刺激胃癌细胞系,发现IL-17A能够诱导其增殖。NTCS、TTCS及TTCS+cromolyn分别刺激肥大细胞,收集上清,ELISA检测发现:IL-17A分泌情况分别为196.5±20.82 pg/ml、817.8±57.83 pg/ml和335.5±42.66 pg/ml,说明cromolyn可显著抑制TTCS介导的肥大细胞分泌IL-17A。体外,在TTCS刺激hCBMC的培养上清中加入IL-17A中和抗体后,胃癌细胞增殖效应受到明显抑制,且细胞凋亡增多。体内,构建荷瘤小鼠模型,与注射肥大细胞+同型对照抗体处理组或注射野生型小鼠来源的肥大细胞处理组相比,注射肥大细胞+IL-17A中和抗体处理组或注射IL-17A^-/-小鼠来源的肥大细胞处理组其瘤体缩小且肿瘤增殖能力下降。以上结果从体外、体内证实,肥大细胞来源的IL-17A可促进胃癌细胞增殖和肿瘤进展。3.胃癌微环境中肥大细胞的表型特征及其调控机制的结果3.1流式细胞术检测发现胃癌组织中肥大细胞PD-L1的表达水平显著高于癌旁组织和非肿瘤正常胃组织中的肥大细胞。相较于NTCS,TTCS可以更显著地上调肥大细胞上PD-L1的表达,且具有时间和剂量依赖关系。3.2 ELISA检测发现:肿瘤组织及TTSC中TNF-α的浓度分别为78.72±8.76 pg/mg和345.4±36.14 pg/ml,分别显著高于非肿瘤正常胃组织中TNF-α的浓度（42.83±4.34pg/mg）及NTCS中TNF-α的浓度（179.8±23.12 pg/ml）。TTCS诱导肥大细胞上调PD-L1的表达,其效应可被TNF-α中和抗体拮抗,表明肿瘤来源的TNF-α在诱导肥大细胞上调表达PD-L1的过程中发挥重要作用。3.3在信号通路研究中,肥大细胞用BAY11-7082预处理后,TTCS诱导其PD-L1表达上调的作用会受到抑制。TTCS刺激BAY11-7082预处理的肥大细胞或在TTCS中加入TNF-α中和抗体后再刺激肥大细胞,Western Blot检测均发现肥大细胞中PD-L1的表达及p65的磷酸化程度受到显著抑制,表明肿瘤来源的TNF-α通过激活NF-κB通路上调肥大细胞表达PD-L1。4.肥大细胞通过发挥免疫抑制功能介导胃癌进展的作用机制及其临床意义的结果4.1肥大细胞与T细胞在胃癌中的浸润程度呈显著的负相关。免疫荧光检测发现肥大细胞与T细胞在胃癌组织中相互接触。4.2体外,胃癌及非肿瘤正常胃组织中原位肥大细胞与T细胞共培养,增殖的T细胞占总T细胞百分比分别为38.80%±5.14%及54.93%±5.09%,IFN-γ⁺T细胞占总T细胞百分比分别为5.93%±0.27%及12.67%±0.26%。以上结果说明,与正常胃组织中的肥大细胞相比,胃癌中浸润的肥大细胞可显著抑制T细胞增殖和IFN-γ的分泌。当胃癌来源的肥大细胞与T细胞的共培养体系中加入PD-L1中和抗体后,增殖的T细胞百分比为54.67%±3.19%,IFN-γ⁺T细胞百分比为9.17%±0.59%,胃癌来源的肥大细胞对T细胞的抑制作用被削弱,说明肥大细胞上PD-L1介导了其对T细胞的抑制作用。4.3体内,构建荷瘤小鼠模型。TTCS诱导的条件肥大细胞（TCM）与T细胞共培养,并在培养体系中加入PD-L1中和抗体或同型对照抗体,腹膜注射于小鼠体内。注射了TCM+T细胞+同型对照抗体的处理组其小鼠的肿瘤生长迅速,其瘤体重量达1.135±0.094 g,提示TCM抑制了T细胞的抗肿瘤功能;相比之下,TCM+T细胞+PD-L1中和抗体的处理组其小鼠瘤体明显缩小,其瘤体重量为0.523±0.024 g,提示TCM对T细胞的抑制作用是由PD-L1所介导的。免疫组织化学染色显示,相较于同型对照抗体的处理组,注射了TCM+T细胞+PD-L1中和抗体的处理组其肿瘤细胞增殖能力下降。以上体内、体外实验结果证实:肿瘤相关的肥大细胞对T细胞的抑制作用是由PD-L1介导的,导致了肿瘤进展加快。4.4分析患者临床资料及肥大细胞在胃癌中的浸润情况,发现肥大细胞的浸润程度与肿瘤的淋巴管浸润、瘤体大小、肿瘤分期等临床特征呈显著的正相关。根据胃癌中浸润的肥大细胞占CD45⁺细胞百分率的中位数（9.315%）,将患者分为肥大细胞高浸润组和肥大细胞低浸润组,高浸润组患者的总生存率和无病生存率显著低于肥大细胞低浸润组。结论1.肥大细胞在胃癌组织中浸润增多,此浸润增多的肥大细胞是通过CXCL12-CXCR4趋化通路向胃癌组织募集的。2.肿瘤来源的ADM通过激活PI3K-AKT信号通路,诱导肥大细胞发生脱颗粒活动,此脱颗粒效应,在体外,促进胃癌细胞增殖,抑制胃癌细胞凋亡;在体内,促进瘤体的生长和肿瘤的进展。此效应可通过中和肥大细胞分泌的IL-17A来阻断。3.肿瘤来源的TNF-α可通过激活NF-κB信号通路,上调肥大细胞PD-L1的表达。4.在体外,肿瘤组织中浸润的原位肥大细胞可通过PD-L1抑制T细胞的增殖和其效应分子的分泌;在体内,TTCS诱导的条件性肥大细胞通过PD-L1抑制T细胞的功能,促进肿瘤的进展。此免疫抑制功能可通过阻断肥大细胞上的PD-L1逆转。5.胃癌组织中浸润增多的肥大细胞与患者某些胃癌晚期临床指标呈正相关,且与胃癌患者不良的预后相关。意义本文阐明了肥大细胞在胃癌中新的促瘤机制和免疫抑制作用,提示胃癌中浸润的肥大细胞在未来可能成为预测患者临床预后的重要指标。本文明确了肥大细胞通过脱颗粒活动释放IL-17A,发挥的促瘤效应;阐明了肥大细胞中TNF-α-PD-L1免疫抑制通路的调控机制及其介导的对T细胞抗肿瘤功能的抑制作用。总之,阻断胃癌中浸润的病理性肥大细胞分泌的促癌性炎症因子IL-17A或其表达的免疫抑制性分子PD-L1,均有希望成为防治胃癌进展的有效手段。