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随着基因组测序工作的不断推进,人类已经进入了以功能基因组研究为主题的后基因组时代,其中一个显著的特点就是,发现新基因和认识基因的生物学功能成为最为紧迫的任务。突变体是功能基因组学研究的重要材料,受到人们越来越广泛的重视。在这样的大背景下,大规模突变体库的构建就成为了功能基因组研究的一个重要内容。获得突变体的方法很多,除了收集自然突变体以外,还有采用人工诱变的方法,如物理化学诱变、基因敲除（knock-out）、基因沉默（gene silence）、插入突变（insertional mutagenesis）等,每种方法都各有其优缺点。定向诱导基因组局部突变——TILLING（Targeting Induced Local Lesions InGenomes）是近年发展起来的一种全新的反向遗传学方法。它的基本原理是:采用特异基因引物对应用化学诱变剂所产生的突变群体进行PCR放大突变信号,经变性和复性过程得到异源双链DNA分子,再用能特异切割错配位点的核酸内切酶（如CEL I）切割异源双链,并用变性电泳检测酶切产物,最后筛选出目的基因突变体。该技术具有通量高、操作简单、成本低等优点,可以有效克服其它获得突变体方法的繁琐、费时等不足,因此被广泛应用于多种生物的功能基因组学研究。我们有理由相信,TILLING技术在家蚕中也能充分体现其潜在的优势并发挥其重要的作用。本研究在前人研究的基础上,应用化学诱变剂N-甲基N-亚硝基脲（MNU）对家蚕进行诱变处理,构建了化学诱变的家蚕突变体库;同时优化了家蚕TILLING技术的检测体系;并在此基础上,以家蚕重要的功能基因之一即丝素基因作为研究对象,初步应用TILLING技术筛选了目标区域的点突变,以期验证该技术在家蚕中应用的可行性并获得丝素基因突变体。主要结果如下:（1）首先调查了诱变剂MNU对家蚕第五天蛹的半致死剂量(LD50),结果表明,注射体积为50μL的情况下,MNU在雌雄蛹中半致死浓度分别为:雌蛹1730μg/mL、雄蛹1416.7μg/mL;即LD50（雌蛹）=86.5μg/头、LD50（雄蛹）=70.8μg/头。其次用MNU对家蚕进行诱变,构建了家蚕突变体库,同时调查了M0代化蛾率和M1代卵的孵化率,结果发现MNU诱变浓度为1000μg/mL时,M0代化蛾率低且M1代卵胚胎致死现象严重;MNU诱变浓度为100μg/mL时,M0代化蛾率及M1代卵的孵化率都明显提高,并获得了较多存活的诱变后代;另外,通过观察诱变后代的可视表型,发现在100μg/mLMNU诱导家蚕第5天蛹的M2代中有一编号为M18-21蛾区的家蚕在幼虫发育到三眠时出现1/4致死现象,且M3代仍呈1/4致死,推测该突变体是MNU诱变产生的隐性致死突变。（2）应用改进后的家蚕基因组DNA提取方法,提取到815个M1代基因组DNA样品;将这些样品排列于96孔微量板上,以单向构池法构建了2个可供TILLING检测筛选的4×DNA池,为家蚕TILLING技术的应用奠定了基础。（3）对家蚕TILLING检测体系中PCR模板量和酶切反应体系进行了优化,结果表明:家蚕TILLING检测过程中用于PCR模板的基因组DNA最适用量为～20ng;用CEL I酶切消化异源双链核酸分子时最适孵育时间为15min,最佳酶用量为每20μL反应体系中加入0.5μL本实验室提取的CEL I酶的10倍稀释液。（4）以丝素基因fib-l和P25为研究对象,初步应用TILLING技术对815个家蚕MNU诱变个体进行检测,其中对fib-l基因检测的碱基数量共计约为810kb,初步筛选到1个突变样C3-2和1个突变体M18-21;对P25基因检测的碱基数量共计约为1500kb,目前暂未检测到突变样。测序结果显示,在样品M18-21中,扩增子Fib-L-C的第107bp处有T和C两个信号的杂合峰,认为是碱基转换突变,即T＞T/C;由于该位点位于内含子区,不会影响编码氨基酸序列;且该突变位点与TILLING凝胶图片中酶切片段大小反映出的信息基本相符。而突变样C3-2中的具体突变个体和突变情况还有待进一步检测和验证。这些结果表明TILLING技术在家蚕中的应用是可行的。综上所述,本研究首先建立了一个MNU诱导家蚕突变库,为TILLING技术在家蚕基因突变体筛选中提供了材料;同时,优化了家蚕TILLING技术的检测体系,为该技术进一步应用奠定了基础;另外,初步应用该技术对丝素基因突变体进行检测并测序验证,获得了1个化学诱导突变体。通过本研究,我们相信TILLING技术将为家蚕功能基因组研究提供更多有效的化学诱导突变体材料,从而推动家蚕基因功能的研究,促进蚕业科学的发展。