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研究目的SDF-1/CXCR4通过PI3K/Akt途径在BMSCs向损伤脊髓组织迁徙的诱导作用及影响因素。研究方法1.用Percoll密度离心法从大鼠骨髓内分离出间充质干细胞并进行传代,以免疫组化的方法(SABC法)进行鉴定。2.用Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。3.用Real-time PCR检测BMSCs中编码CXCR4和P13K基因的存在。4.用Western Bolt检测BMSCs表面CXCR4和P13K的蛋白表达。5.用Transwell小室迁徙实验为主要的体外实验方法,研究SDF-1/CXCR4对BMSCs的体外迁徙诱导作用并精确测定SDF-1的最佳诱导浓度。实验分为：阴性对照组(上室加入BMSCs细胞悬液,下室加入不含SDF-1的血清培养基)；实验组(上室加入BMSCs细胞悬液,下室加入含不同浓度SDF-1的血清培养基)；CXCR4阻断组(上室加入CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液,下室加入不同浓度的SDF-1的血清培养基);试剂对照组(上室加入CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液,下室加入不含SDF-1的血清培养基)。用不同干预措施后急性脊髓损伤模型大鼠的脊髓功能恢复情况(后肢运动BBB评分)研究SDF-1/CXCR4对BMSCs向脊髓损伤组织迁徙的影响。实验分为：空白对照组(模型大鼠不给予任何处理)；阴性对照组(模型大鼠尾静脉注射生理盐水)；试剂对照组(模型大鼠尾静脉注射AMD3100); BMSCs移植组(模型大鼠尾静脉注射BMSCs细胞悬液)、CXCR4抑制组(模型大鼠尾静脉注射CXCR4抑制剂预处理过的BMSCs细胞悬液)。6.用Transwell小室迁徙实验为主要的体外实验方法,研究PI3K/Akt途径在SDF-1/CXCR4趋化BMSCs过程中的影响。实验分为：阴性对照组(上室加入BMSCs细胞悬液,下室加入不含SDF-1的血清培养基),试剂AMD3100对照组(上室加入CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液,下室加入不含SDF-1的血清培养基),CXCR4抑制组(上室加入CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液,下室加入含SDF-1的血清培养基),试剂LY294002对照组(上室加入PI3K抑制剂LY294002预处理过的BMSCs细胞悬液,下室加入不含SDF-1的血清培养基)),PI3K抑制组(上室加入PI3K抑制剂LY294002预处理过的BMSCs细胞悬液,下室加入含SDF-1的血清培养基),外源性处理组(上室加入CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液和外源性PI3K产物PIP3,下室加入含SDF-1的血清培养基)。用不同干预措施后急性脊髓损伤模型大鼠的脊髓功能恢复情况(后肢运动BBB评分)研究SDF-1/CXCR4对BMSCs向脊髓损伤组织迁徙的影响。实验分为：空白对照组(模型大鼠不给予任何处理)；阴性对照组(模型大鼠尾静脉注射生理盐水)；试剂AMD3100对照组(模型大鼠尾静脉注射AMD3100)；试剂LY294002对照组(模型大鼠尾静脉注射LY294002)；BMSCs移植组(模型大鼠尾静脉注射BMSCs细胞悬液)；CXCR4抑制组(模型大鼠尾静脉注射CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液)；PI3K抑制组(模型大鼠尾静脉注射PI3K抑制剂LY294002预处理过的BMSCs细胞悬液)；外源性处理组(模型大鼠尾静脉注射CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs细胞悬液和外源性PI3K产物PIP3)。7.本研究中,均值以x±s表示。用方差分析(Analysis of variance, ANOV)分析多组间的差异,组间的两两比较用q检验进行分析。所有数据用统计分析软件包(Statistic Package for Social Science, SPSS)17.0处理,以P<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果1. BMSCs的细胞形态及免疫组化鉴定：典型的BMSCs呈长梭形或多角形的成纤维细胞样,有长短、粗细不一的胞浆突起。细胞早期呈集落样生长,集落呈放射状或漩涡状,后期细胞逐渐密集,集落不可分辨。免疫组化显示CD34-、CD44+、CD54+、CD99+。2. Allen打击法建立大鼠急性损伤模型：用70g.cm的能量对大鼠T10-11水平脊髓进行垂直打击,打击瞬间可见大鼠四肢及躯体抽搐,尾部呈痉挛样摆动,表示打击成功。3-5min后可见受损伤脊髓呈暗红色,有出血、水肿表现。建模后饲养一周,后肢运动BBB评分从术前的18.73±0.85降至术后的3.04±0.65,差异具有统计学意义(P<0.05)。3. BMSCs中CXCR4和PI3K的基因存在和蛋白表达：BMSCs存在CXCR4基因和PI3K基因,Real-time PCR的扩增ACT值分别为16.47和13.43。CXCR4和PI3K在BMSCs中均有蛋白表达。4. SDF-1/CXCR4对BMSCs迁徙的诱导作用：在体外实验中,试剂对照组和阴性对照组迁徙到下室的细胞数没有明显差异(P>0.05),试剂AMD3100本身对BMSCs的迁徙没有影响。在此基础上,相比阴性对照组,下室中加入SDF-1无血清培养基的小室,迁徙到下室的细胞数都有增加(P<0.05),且随着下室中SDF-1浓度的增加而增加。SDF-1浓度为144.5±4.4ng/ml时达到最佳迁徙效果,继续增加SDF-1浓度,迁徙到下室的细胞数也不会随之增加。AMD3100阻断CXCR4后,SDF-1对BMSCs不再有诱导迁徙作用(P>0.05)。5. P13K/Akt途径对SDF.1/CXCR4诱导BMSCs迁徙的影响：在体外实验中,验证试剂AMD3100和LY294002对BMSCs的自然迁徙没有影响的基础上(P>0.05),CXCR4抑制组和PI3K抑制组迁徙到下室的细胞数均小于正常的SDF-1趋化组(P<0.05),而在CXCR4抑制组中外源性的加入PI3K产物PIP3,则又可以观察到SDF-1的趋化作用。在体内实验中,验证了试剂AMD3100、LY294002以及注射操作对实验结果没有影响(P>0.05),向模型大鼠尾静脉注射PI3K抑制剂LY294002预处理过的BMSCs悬液与注射CXCR4抑制剂AMD3100预处理过的BMSCs悬液,模型大鼠的脊髓功能恢复程度均相同,均介于移植BMSCs组和阴性对照组之间(P<0.05)。在CXCR4抑制组中外源性的加入PI3K产物PIP3,模型大鼠的脊髓功能恢复与不抑制CXCR4时的效果相同(P>0.05)。研究结论1. Percoll密度离心法可以从大鼠长骨骨髓中分离出纯度较高的BMSCs。2. Allen打击法能够建立符合要求的大鼠急性损伤模型。3. SDF-1/CXCR4可以诱导BMSCs向受损的脊髓组织迁徙。4.SDF-1浓度为144.5na/ml时SDF-1/CXCR4对BMSCs的迁徙诱导效果达到最佳。5. PI3K/Akt途径是SDF-1/CXCR4诱导BMSCs向受损脊髓组织迁徙的下游机制。