肺癌是世界上发病率及癌症相关死亡率最高的恶性肿瘤,其中85%为非小细胞肺癌,绝大多数肺癌患者在诊断时已属晚期,早期发现的肺癌患者,即使是经过正规的治疗,其5年生存率仅为17%,发生转移的晚期患者的5年生存率则仅为4%。因此如何更有效的治疗肺癌,延长癌症患者的生存期无疑是目前研究的热点。癌症的个体化治疗无疑是肺癌治疗最有效的方法,该方法是基于患者肿瘤基因学特征制定治疗方案。ALK抑制剂克唑替尼的发明及应用就是一个成功治疗非小细胞肺癌例子,其可以极大的改善ALK基因突变型肺癌患者的预后。克唑替尼是一种具有多种酪氨酸激酶活性的抑制剂,包括MET、ALK及ROS1,其可以作为分子靶向药物用于治疗ALK阳性的晚期非小细胞肺癌,临床实验表明,接受克唑替尼治疗的患者客观缓解率(ORR)接近60%,另一项研究则达到了50%的ORR,基于此,FDA批准克唑替尼用于治疗ALK阳性的肺癌患者。近期,PROFILE 1014临床实验评估了一线化疗方案培美曲塞联合铂类与克唑替尼单药治疗晚期ALK阳性非小细胞肺癌患者,结果显示克唑替尼有着更显著的PFS、ORR,副作用更少。因此,目前克唑替尼靶向治疗ALK阳性肺癌患者被推荐为治疗该种肺癌的一线治疗方案。不幸的是,向应用其他抗肿瘤药物一样,所有患者接受克唑替尼治疗的过程中耐药的出现无可避免,该时间通常在1年之内,耐药机制较复杂。因此寻找一种可以增加常规治疗如化疗,放疗,分子靶向治疗的敏感性的方法,延缓耐药的发生是目前解决肿瘤耐药的一种新的途径。mi R-200c作为mi R-200家族中的代表,在很多肿瘤组织中低表达,能够调节上皮-间质转变(EMT)和肿瘤的侵袭转移,在间质细胞中过表达mi R-200c能够促使间质细胞向上皮细胞转化。可以曾强肺癌细胞对多种化疗药物、EGFR-TKI药物及放疗的敏感性,但是,mi R-200是否可以提高ALK阳性肺癌细胞对克唑替尼的敏感性尚未可知,本研究旨在研究mi R-200c调节ALK阳性肺癌细胞对克唑替尼敏感性的作用,并试探讨其作用机制。第一部分克唑替尼对H2228,A549及H460肺癌细胞株增殖和迁移的影响目的:检测克唑替尼药物对包括ALK阳性肺癌细胞在内的不同肺癌细胞系增殖和迁移的影响,为下一步实验奠定基础。方法:H2228细胞系,为EML4-ALK融合基因阳性肺腺癌细胞,购于ATCC(American Type Culture Collection)公司;A549(肺腺癌细胞株)及H460(人高转移大细胞肺癌株)两种细胞系由中国医学科学院基础医学研究所赠送。将细胞培养于RPMI1640培养液中,其中含有10%的胎牛血清,常规置于37℃、5%CO2、100%湿度的细胞培养箱中。应用四甲基噻唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和细胞计数法检测3种肺癌细胞系H2228,A549和H460在不同浓度(0,25,50,100,200nmol/L)的克唑替尼下增殖活性变化。同样地,检测H2228细胞系在100nmol/L时不同时间(0,24,48,72h)下的增殖情况。Transwell小室方法检测克唑替尼对H2228,A549和H460细胞迁移活性的影响。将H2228,A549和H460细胞用浓度为(0,25,50,100nmol/L)的克唑替尼处理48小时后,然后应用Transwell小室法检测。结果:1克唑替尼对H2228,A549及H460肺癌细胞增殖的影响分别用浓度为0,25,50,100,200nmol/L的克唑替尼处理H2228,A549及H460肺癌细胞48 h后,MTT和细胞计数实验的结果显示:克唑替尼对ALK阳性肺癌细胞H2228增殖起抑制作用,并且随着克唑替尼浓度的增加而增强(P<0.05,P<0.01),通过统计软件计算IC50为:121.91nmol/L。克唑替尼对ALK突变阴性肺腺癌A549细胞及高转移大细胞肺癌株H460细胞的增殖抑制率较弱,只有较大剂量时200nmol/L才有轻微的抑制作用(22%和19.7%,P<0.05)。用100 nmol/L的克唑替尼处理H2228细胞24,48和72 h,分别MTT和细胞计数的结果显示:随着克唑替尼作用时间的延长,克唑替尼对H2228细胞增殖的抑制作用逐渐增强(P<0.05)。综上,这些结果说明克唑替尼对H2228细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。2克唑替尼对H2228,A549及H460肺癌细胞迁移的影响Transwell小室实验结果显示:分别用浓度为0,25,50,100,200nmol/L的克唑替尼处理H2228,A549及H460肺癌细胞细胞48h,随着克唑替尼浓度的增加,其对H2228细胞迁移活性抑制增强(P<0.05,P<0.01)。而对A549及H460细胞的抑制则无明显增强,结果表明:克唑替尼对H2228细胞侵袭存在剂量依赖性抑制作用。结论:克唑替尼作为ALK阳性肺癌细胞的分子靶向药物,对肺癌H2228细胞的增殖、迁移起抑制作用,且该作用具有剂量和时间依赖性。第二部分mi R-200c对克唑替尼抑制H2228细胞增殖性及迁移的影响及机制目的:观察mi R-200c对克唑替尼抑制H2228细胞增殖性及迁移的影响并试探讨其机制。方法:H2228细胞瞬时转染mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control(NC),mi R-200c inhibitor及mi R-200c inhibitor NC;MTT法分别检测克唑替尼对H2228细胞及转染了mi R-200c mimicis、mi R-200c inhibitor H2228细胞增殖情况的影响;Transwell法检测H2228细胞及转染了mi R-200c mimicis、mi R-200c inhibitor H2228细胞迁移情况;生物信息学网站及软件查询预测mi R-200c作用靶基因,双荧光素酶报告系统验证ZEB1为mi R-200c的靶基因;实时定量PCR方法检测H2228细胞及转染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin及CD24的m RNA表达水平的变化;Western-blot技术检测H2228细胞及转染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表达水平的变化。结果:1 H2228肺癌细胞转染mi R-200c mimicis及阴性对照mimicis NC,转染mi R-200c inhibitor及阴性对照inhibitor NC后检测转染效果为检测mi R-200c对H2228细胞的影响,对该细胞进行mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control(NC),mi R-200c inhibitor及mi R-200c inhibitor NC的转染,我们发现H2228细胞转染24小时后应用RT-PCR方法检测mi R-200c的表达结果:mi R200c表达水平明显增高,较阴性对照增高310倍,两者差异有显著统计学意义(P<0.01);相反,转染mi R-200c inhibitor及阴性对照inhibitor NC后,mi R-200c表达水平则明显降低,较阴性对照降低3.5倍,两者差异有统计学意义(P<0.05)。2 micro RNA-200c增加H2228细胞对克唑替尼的敏感性分别用浓度为50n M、100n M及200n M的克唑替尼处理转染了mi R-200c mimicis及阴性对照mimicis NC的H2228细胞后发现,转染mi R-200c mimicis后的细胞在以上各种浓度下,克唑替尼的抑制作用明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。同样,细胞转染mi R-200c inhibitor,抑制细胞mi R-200c表达后,克唑替尼在以上各种浓度下,对细胞的抑制作用较转染阴性对照组明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05及P<0.01)。3 micro RNA-200c抑制H2228细胞迁移能力我们同时应用Transwell小室检测转染mi R-200c mimicis及阴性对照mimicis NC,转染mi R-200c inhibitor及阴性对照inhibitor NC的H2228细胞,我们发现增强细胞mi R-200c的表达后,细胞迁移能力明显受到抑制(P<0.01),相反,抑制mi R-200c表达后,细胞迁移能力增强(P<0.05)。4双荧光素酶报告系统验证ZEB1为mi R-200c的靶基因。双荧光素酶报告基因分析结果所示,Negative Control mi RNA转染组(阴性对照组)、mi R-200c mimic转染组ZEB1的相对荧光强度显示,mi R-200c mimics转染组能够降低ZEB1相对荧光强度(P<0.05)5 mi R-200c对H2228细胞EMT标志物表达的影响通过q RT-PCR检测转染了mi R-200c mimicis及阴性对照mimicis NC的H2228细胞,其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的m RNA表达水平的不同。发现转染了mi R-200c mimicis的H2228细胞,其N-cadherin,Vimentin,CD24的m RNA表达水平较阴性对照组明显减低(P<0.05及P<0.01),而E-cadherin的m RNA表达水平较阴性对照组明显增高(P<0.01)。相应的,应用western blot分析方法检测转染了mi R-200c mimicis及阴性对照mimicis NC的H2228细胞,其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表达水平的不同,发现与m RNA表示差异相似,转染了mi R-200c mimicis的H2228细胞,其N-cadherin,Vimentin,CD24的蛋白表达水平较阴性对照组明显减低(P<0.05),而E-cadherin的蛋白表达水平较阴性对照组明显增高(P<0.01)。结论:mi R-200c过表达可以通过调节ZEB1,使靶细胞发生EMT改变,可以增加ALK阳性肺癌细胞H2228对克唑替尼的敏感性并可以抑制H2228细胞的迁移性。第三部分:耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞株H2228/CR的培养及特点目的:通过对耐克唑替尼ALK阳性肺癌细胞株H2228/CR的培养,进一步了解耐药细胞发生的变化并探讨耐药发生的机制。方法:体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法,建立H2228细胞对克唑替尼的耐药细胞株H2228/CR;观察ALK阳性肺癌细胞株H2228和其耐药细胞株H2228/CR的形态学变化;MTT法检测鉴定克唑替尼对H2228及其耐药细胞株H2228/CR增殖活性的影响,计算H2228/CR细胞的IC50及耐药倍数:Transwell法分别检测H2228及H2228/CR细胞的迁移率;RT-PCR方法检测H2228及H222/8CR细胞N-cadherin,Vimentin,E-cadherin、ZEB1及ZEB2的m RNA表达差异;Western blot实验方法检测H2228及H2228/CR细胞N-cadherin,Vimentin,E-cadherin、ZEB1及ZEB2的蛋白表达差异。结果:1耐克唑替尼细胞系H2228/CR对克唑替尼明显耐药经过6个月余的培养,我们最终获得了耐药细胞H2228/CR,该细胞可以在800n M浓度的克唑替尼药物中生长。低倍镜下观察H2228细胞及H2228/CR细胞,发现耐药细胞形态学上明显发生了变化,由椭圆形变为纺锤形,细胞排列较松散。MTT法测定细胞生存率发现,克唑替尼对H2228/CR细胞的抑制作用明显减弱,对亲代H2228细胞的IC50为121.9n M对H2228/CR细胞的IC50为2618.45n M,耐药增加了21.5倍。2耐药细胞H2228/CR有着更高的侵袭力应用Transwell法检测H2228细胞及H2228/CR细胞的迁移率,我们发现,细胞的迁移率较亲代细胞H2228明显增高(P<0.05),差异有统计学意义。3 H2228/CR细胞发生EMT改变如上所述,H2228/CR细胞由椭圆形向纺锤形改变,排列较分散,提示可能存在间质改变。用RT-PCR和western blot实验进一步检测H2228CR细胞中EMT标志物的改变,检测H2228/CR细胞的分在标记物后发现其E-cadherin无论在m RNA水平还是在蛋白水平表达均较亲代H2228细胞明显减低,而N-cadherin,Vimentin,则在m RNA及蛋白水平均增高。结论:1耐克唑替尼药物的ALK阳性肺癌细胞H2228/CR细胞培养成功,耐药倍数为21.5倍,达到进一步实验要求。2耐药细胞株H2228/CR较原始非耐药细胞有着更明显的侵袭性且发生了EMT改变。第四部分mi R-200c通过靶向调节ZEB1逆转EMT增加耐克唑替尼H2228/CR细胞对克唑替尼的敏感性目的:耐克唑替尼细胞株H2228/CR转染mi R-200c,研究转染后细胞迁移性及对克唑替尼药物敏感性变化并探讨机制。方法:RT-PCR方法检测H2228细胞及H2228/CR细胞mi R-200c的表达;H2228/CR细胞瞬时转染mi R-200c mimicis,mi R-200c mimicis negative control;MTT法分别检测克唑替尼对H2228细胞及H2228/CR转染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后细胞增殖抑制情况;Transwell法检测H2228细胞及H2228/CR转染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后细胞迁移情况;实时定量PCR方法检测H2228细胞及H2228/CR转染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin及CD24的m RNA表达水平的变化;Western-blot方法检测H2228细胞及转染mi R-200c mimicis后其N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的蛋白表达水平的变化。结果:1 mi R-200c在耐药细胞H2228/CR中表达较H2228细胞明显降低应用RT-PCR方法同时检测H2228细胞及H2228/CR细胞的mi RNA-200c的表达发现,与亲代细胞H2228比较,耐药细胞H2228/CR的mi R-200c减低23.4倍。2恢复表达mi R-200c后,H2228/CR细胞对克唑替尼敏感性增加H2228/CR转染mi R-200c mimicis及阴性对照mimics-NC,RT-PCR方法检测转染效果显示,H2228/CR转染mi R-200c mimicis后其mi R-200c表达较H2228及H2228/CR阴性转染明显增高。MTT方法检测克唑替尼对以上3种细胞的抑制情况发现,转染mi R-200c mimicis的H2228/CR细胞的增殖受克唑替尼的抑制较转染了阴性对照mimicis NC组的细胞明显增强,但未恢复到克唑替尼对亲代H2228细胞即耐药前的抑制水平。3恢复表达mi R-200c后,H2228/CR细胞的迁移降低Transwell方法检测H2228细胞及H2228/CR转染mi R-200c mimicis、mi R-200c mimicis NC后细胞迁移情况发现,转染mi R-200c mimicis的H2228/CR细胞的迁移性较转染了阴性对照mimicis NC组的细胞明显减低,但仍高于亲代H2228细胞的迁移率。4 mi R-200c逆转H2228/CR细胞发生的EMT改变用RT-PCR实验进一步检测H2228细胞及转染mi R-200c mimicis和转染mi R-200c mimicis NC后H2228/CR细胞中N-cadherin,Vimentin,E-cadherin和CD24的m RNA变化,我们发现,转染了mi R-200c mimicis的H2228/CR细胞其E-cadherin的m RNA表达较阴性对照增高(P<0.05),较亲代H2228细胞减低更明显(P<0.01),而N-cadherin,Vimentin和CD24的m RNA表达较阴性对照明显减低(P<0.01),较亲代H2228细胞增高(P<0.05)。同样,与m RNA表达相对应,应用Western-blot方法检测以上3中细胞相应蛋白表达发现,转染了mi R-200c mimicis的H2228/CR细胞其E-cadherin的蛋白表达较阴性对照增高(P<0.05),但较亲代H2228细胞减低(P<0.01),而N-cadherin,Vimentin和CD24的蛋白表达表达较阴性对照明显增高(P<0.05),较亲代H2228细胞增高更明显(P<0.01)。结论:1耐克唑替尼细胞H2228/CR其mi R-200c表达较亲代明显减低,恢复表达mi R-200c后,H2228/CR细胞对克唑替尼的敏感性增加,迁移率减低。2通过检测相关m RNA及蛋白表达水平发现,mi R-200c是通过逆转EMT过程而增加H2228/CR对克唑替尼的敏感性