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泡菜是我国历史悠久且风味独特的一类冷加工蔬菜制品。目前我国的泡菜生产企业仍沿用自然发酵的传统工艺,发酵菌种杂且未经鉴定、发酵条件难控制、产品质量难稳定,存在一定食品安全隐患,这些问题己严重制约了我国泡菜产业的发展。鉴于目前泡菜生产中存在的现实问题,本文开展了直投式发酵泡菜益生乳酸菌的选育和菌剂制备及其益生特性研究,研制出直投式泡菜发酵益生乳酸菌剂进行泡菜发酵,既可解决我国泡菜产业中长期存在的食品稳定性和安全性问题,又可生产出具有良好保健功能的泡菜产品,达到高值高效转化大宗蔬菜农产品的目的。本研究可建立我国泡菜产业共性技术创新平台,扭转我国发酵菌剂产品长期依赖进口的被动局面,为我国的经济建设和解决“三农”问题做出重要贡献。本文主要研究内容与结论如下:
1、研究了我国传统泡菜发酵过程中乳酸菌菌系变化及其消长规律。结果显示:肠膜明串珠菌肠膜亚种、粪肠球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和玉米乳杆菌主导整个泡菜发酵过程。肠膜明串珠菌肠膜亚种和粪肠球菌在泡菜发酵初期(Od)即存在于泡菜发酵液中,而其它四种乳酸菌是在发酵过程中相继出现。粪肠球菌和乳酸乳球菌乳酸亚种主要存在于泡菜发酵早期,在发酵中期就从泡菜发酵液中消失了。肠膜明串珠菌肠膜亚种到5d时从泡菜发酵液中消失了。玉米乳杆菌主要存在于泡菜发酵中期,到5.5d时泡菜发酵液中已检测不到了。植物乳杆菌和干酪乳杆菌主要存在于泡菜发酵的中后期并完成整个发酵过程。研究结果阐明:肠膜明串珠菌是典型的异型乳酸发酵菌,启动整个泡菜发酵过程,其产生的CO2为其他参与泡菜发酵的乳酸菌生长提供了厌氧条件;随后是粪肠球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、玉米乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌等参与泡菜的中期发酵,大量产酸,是典型的同型乳酸发酵过程;最后由植物乳杆菌、干酪乳杆菌完成整个泡菜发酵过程。
2、根据泡菜发酵菌系的研究结果,本研究设计目的培养基,从中国传统泡菜老液中筛选出泡菜发酵性能优良、能耐高浓度胆盐和酸环境,能通过模拟人体胃屏障,顺利到达肠道的功能性泡菜发酵专用菌株。通过泡菜发酵性能测定,筛选出其中发酵性能最佳的编号NCU116菌株,经生理生化、16S Rrna和pheS基因序列分析鉴定,确定该菌株为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)。
3、应用响应面法优化植物乳杆菌NCU116平衡培养基配方,利用中和法与指数流加法研究植物乳杆菌NCU116高密度培养条件。结合单因素实验结果,采用SAS软件进行中心组合设计和响应面法优化发酵培养基。优化后的平衡培养基配方为:葡萄糖5.43％、蛋白胨0.98%、K2HPO40.59%;研究植物乳杆菌NCU116高密度培养条件,利用15L全自动发酵罐,在接种量3%、Ph6.5、培养温度35℃的最佳条件下,采用氨水中和法和指数流加碳、氮源培养基,最终发酵液中植物乳杆菌NCU116菌体浓度达到9.3×10~CFU/Ml。
4、采用单因素实验和正交实验设计筛选和优化植物乳杆菌NCU116真空冷冻干燥的保护剂配方;研究了离心条件、离心前发酵液Ph值、物料厚度和预冷冻时间等冻干条件对细胞活性的影响,测定了其共晶点、共熔点和崩解温度,并研究了快速冻干和慢速冻干的效果,以及两步法真空冷冻干燥技术条件。最终确定两步法真空冷冻干燥技术参数为:保护剂5%海藻糖、10%脱脂奶粉和2%甘油;离心前发酵液Ph6.0,4000r/min离心15min,共晶点温度为-31℃,共熔点温度为-30.8℃,崩解温度范围为-32.9℃～-27℃,快速冻干效果高于慢速冻干,平皿中物料厚度4mm,34℃真空干燥2h,-50℃下预冷冻2h,再真空冷冻干燥18h。两步法真空冷冻干燥后样品菌体浓度达9.8×1011CFU/g,含水率为0.61%,一步法真空冷冻干燥后样品菌体浓度为5.8×1011CFU/g,含水率为1.94%,两步法的冻干效果明显高于一步法,具有良好的推广应用前景。
5、以植物乳杆菌NCU116菌剂作为直投式发酵剂,研究传统自然发酵泡菜与直投式发酵泡菜过程中Ph值、酸度以及肠道病原菌(大肠菌群、沙门氏菌与金黄色葡萄球菌)的变化。结果表明,直投式发酵泡菜工艺可大幅度提高产酸速度和产酸能力,明显加快泡菜发酵速度、缩短发酵时间;可显著降低泡菜发酵过程中三种病原菌的数量(P＜0.05),使其数量一直处于较低水平,且在发酵的第2d消失,表明直投式发酵泡菜中植物乳杆菌NCU116对泡菜发酵过程中病原菌的生长具有显著的抑制作用。
6、模拟人体消化道环境,即在人工胃液、人工肠液、胆盐和高盐环境下对植物乳杆菌NCU116的耐受力进行研究。结果表明,植物乳杆菌NCU116在Ph1.5和Ph2.5的人工胃液中培养3h,存活率分别达到了32.62%和45.76%,在Ph值3.5以上的人工胃液中能保持很高的存活率;在人工肠液中作用4h,存活率达到了49.63%;在质量浓度0.03～1.00g/100mL的牛胆盐中培养24h后,活菌数随牛胆盐的增加而降低,但活菌数均保持在107CFU/ML以上;在质量浓度1～8g/100mL的NaCl高盐环境中培养24h后,活菌数随NaCl的增加而稍有降低,当NaCl质量浓度达到8g/100mL时,活菌数仍在108CFU/ML,以上。这表明植物乳杆菌NCU116对人工胃液、人工肠液、胆盐和高盐具有很好的耐受力,能在人体消化道中保持较好的存活率。在食品和保健品工业中具有良好的应用前景。
7、在人体肠道上皮细胞和粘膜表面的黏附性能是益生菌筛选的重要标准之一。模拟人体肠道环境,采用体外细胞模型人体结肠癌细胞系HT-29考察植物乳杆菌NCU116的黏附性,并研究不同因素对NCU116黏附HT-29的影响。结果显示植物乳杆菌NCU116的黏附能力较强,达到4.784±0.21 CFU/cell。黏附菌数随菌体浓度升高而增加,当菌体浓度达到1.0×108CFU/ML时趋于饱和。稳定期的黏附效果较好,黏附数随着作用时间的延长而增加,到2.0h时逐渐趋于饱和。外部环境的Ph值对黏附性质有很大影响,偏酸性环境更有利于黏附进行。Ca2+、Mg2+对菌体与HT-29细胞的黏附作用没有显著影响。这表明植物乳杆菌NCU116在宿主体内有较好的黏附性,在食品行业和保健业中具有良好的发展前景。
8、以9种常见病原菌和非病原菌作为指示菌,采用牛津杯法对植物乳杆菌NCU116发酵液、菌体及代谢产物进行体外抑菌试验。结果显示NCU116对其中3株乳酸菌无抑制作用,对大肠埃希氏菌ATCC25922的抑制作用最强。进一步研究了不同浓度样品、不同有机酸、排除有机酸及过氧化氢干扰以及经Ph调节、热处理、酶处理后NCU116对大肠埃希氏菌ATCC25922的抑菌活性影响。结果表明,样品浓度对抑菌效果无明显影响;产生的抑菌物质中除有机酸外还有其他活性物质,如小分子多肽类细菌素、H2O2等;低Ph是产生抑菌效果的一个重要条件。综合表明,植物乳杆菌NCU116有较强的抑制病原菌效果,主要抑菌物质为菌体及其代谢产物中的各种有机酸和小分子多肽类细菌素等。