食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金免疫快速检测技术研究

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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是单端孢霉烯族毒素之一,广泛存在于谷物和饲料中,严重危害人类和动物的健康。目前的检测方法操作繁琐,大多需要专门的仪器进行配套检测,无法满足快速、简便、现场检测的要求。本文以多克隆抗体和胶体金合成标记技术为基础,根据免疫层析的原理,建立了食品中DON胶体金免疫快速检测方法。通过DCC法合成DON完全抗原,DON与BSA的初始摩尔比为50:1,得到DON完全抗原中DON与BSA的摩尔比为9.7:1。通过红外光谱扫描以及ELISA实验验证了DON-BSA的偶联成功。将DON-BSA免疫新西兰大白兔,得到抗体的最高效价为12800,抑制率IC50为10μg/mL,与T-2毒素、NIV的交叉反应率分别为9.1%,4.9%。采用柠檬酸三钠还原法成功制备了粒径为10 nm和20 nm的胶体金,并在紫外图谱上进行了表征。胶体金标记抗体的最适pH为9.0,最适抗体加入量为0.066 mg/mL、0.072 mg/mL。胶体金标记抗血清得到免疫胶体金探针,胶体金、抗体溶液、免疫探针复合物做紫外扫描,280 nm附近有蛋白特征峰出现,与胶体金复合后,原出现在520 nm处的胶体金的特征峰,峰值增高,并平移至540 nm附近,证明大分子蛋白抗体与胶体金偶联成功。标记前后的抗体蛋白红外光谱扫描的结果表明,标记前后抗体蛋白的特征基团结构没有发生明显的变化。对抗体探针进行荧光光谱扫描分析,胶体金对抗体蛋白的内源荧光有猝灭作用,并且随着胶体金浓度的增加,抗体的荧光强度呈现有规律的降低,发射光的位置不变。以胶体金标记多克隆抗体作为探针,DON-BSA作为竞争抗原,构建了胶体金免疫检测体系(GICA)。确定最佳包被抗原浓度为10μg/mL,缓冲液体系:10%甲醇+0.05%吐温20的pH 7.4 PBS溶液,胶体金的最佳粒径20 nm左右。GICA目测检出限为1 mg/kg,检测时间为1015 min。方法的重复性良好。方法的稳定性良好,试纸条室温保存3个月,4℃保存6个月。对自然污染的样品进行ELISA和GICA检测,结果证明两者有良好的一致性。
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