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目的角膜移植术是目前器官和组织移植成功率最高的手术,但术后的免疫排斥反应仍是手术失败的最主要的原因。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能够抑制多种免疫细胞(包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及树突状细胞)的增殖和功能。本研究采用MSCs和/或环孢霉素A(cyclosporin A,CsA)治疗大鼠角膜移植免疫排斥反应,检测MSCs在角膜移植大鼠体内能否发挥免疫调节作用,以及其可能的作用机制,试图建立MSCs移植治疗角膜移植排斥反应的技术平台。方法1.原代培养Lewis或Wistar大鼠MSCs,达90%融合时传代培养。用流式细胞仪检测培养细胞的表型,并做体外诱导分化实验,以备后续实验使用。2.制作大鼠角膜移植动物模型,随机分为6组。A组给予等量不含药物的PBS,B组术后肌注CsA,C组术前尾静脉注射MSCs,D组术后尾静脉注射MSCs,E组术前注射MSCs+术后肌注CsA, F组术后注射MSCs+术后肌注CsA。裂隙灯下对角膜植片进行临床观察,以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准,比较6组角膜植片的平均存活时间。术后10d,A组与D组病理组织学检查角膜的结构变化。3.角膜移植模型建立后10天,收集A组与D组大鼠脾脏以及腹股沟淋巴结,分离单个核细胞,在刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA)刺激下孵育72h后,采用BrdU试剂盒检测各组大鼠免疫应答强度。4.取ConA刺激下A组与D组大鼠脾脏和淋巴结单个核细胞孵育72h后的上清液,采用ELISA试剂盒检测Thl类和Th2类细胞因子分泌情况。5.角膜移植模型建立后10天,取A组和D组大鼠外周血,流式细胞仪测定CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比。6.角膜移植模型建立后10天,收集A组和D组大鼠脾脏以及淋巴结,分离单个核细胞,提取总RNA,采用RT-PCR测定FOXP3mRNA表达水平。结果1.成功分离并鉴定了MSCs, MSCs呈间质细胞特性:梭形,漩涡状排列。VonKossa染色、油红染色贴壁细胞呈骨样细胞及脂肪样细胞分化。2.成功建立大鼠角膜移植动物模型。3.采用MSCs治疗角膜移植术后大鼠,除C组外,B组、D组、E组和F组角膜植片的存活时间与A组相比明显延长,D组与B组、E组与F组相比有显著差异,但B组、E组与F组3者之间统计学无显著性差异(P>0.05)。组织学检查发现D组角膜植片中炎性细胞和新生血管明显轻于A组。4.体外和体内T细胞增殖实验表明,MSCs可以显著抑制致病性T细胞增殖(P<0.05)。5.ELISA结果显示,D组Th1细胞因子分泌显著降低(P<0.05),而Th2细胞因子(IL-4)分泌升高(P<0.05),但IL-10分泌两者无显著性差异。6.与对照组相比,D组大鼠体内调节性T细胞比例显著增高(P<0.05),实时定量PCR检测也发现FOXP3-mRNA在D组表达量显著高于对照组(P<0.05)。结论MSCs可以通过抑制T细胞免疫应答、改变Th1/Th2应答平衡以及上调调节性T细胞,有效预防并治疗角膜移植免疫排斥反应。本研究证实了通过调节机体免疫系统,MSCs对免疫性疾病具有治疗作用。