【摘 要】
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本研究着重是利用肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxingenic Escherichia Coli,ETEC)的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门氏菌(Salmonella enteria)的irob基因设计三对引物,建立一个能同
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本研究着重是利用肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxingenic Escherichia Coli,ETEC)的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门氏菌(Salmonella enteria)的irob基因设计三对引物,建立一个能同时检测ETEC和肠沙门氏菌的多重PCR方法。建立多重PCR方法的关键是确定三对引物的浓度、镁离子浓度和退火温度这三个参数,经多次反复试验,最后将多重PCR的最佳引物浓度定为LT引物1pmol/μl、ST引物0.5pmol/μl、iroB引物0.3pmol/μl,最佳镁离子浓度定为3.5mmol/L,最佳复性温度定为50℃,通过做重复性试验可知该多重PCR方法重复性为100%;另外,对多重PCR产物进行测序,并用DNAstar软件和基因库中已发表的LT-A、ST-1和iroB基因序列分析比较,结果可知,用该多重PCR方法扩出来的ST-1、LT-A和irob基因序列的同源性分别达100%、72%和99%;进一步做特异性和灵敏性试验,结果表明,该方法特异性为100%、灵敏度达10-10~2个菌/ml、而且检测时间大大缩短,7-8h内就能得出结果;与其他检测方法进行比较,显然该方法操作简便、快速、准确、灵敏。用建立的多重PCR方法对30份临床可疑腹泻样品进行检测,结果表明,该方法在肉品ETEC和肠沙门氏菌的日常检测中具有一定的实际意义。
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