论文部分内容阅读
近年来,在诸多癌症中均观察到血清N-聚糖的异常变化,表明血清N-聚糖能够作为癌症诊断的新型生物标志物。然而,鉴于天然N-聚糖的性质,在N-聚糖标志物研究中仍面临诸多挑战。因此,本文建立了多种衍生策略用于N-聚糖的定性定量分析,并对特异性癌症标志物进行筛选。主要研究内容如下:将甲胺化和还原化双衍生策略同nano LC-ESI-MS相结合用于血清N-聚糖异构体的分离分析。通过对胰腺癌和健康样本血清N-聚糖异构体进行统计,筛选出25个具有显著差异的异构体,其中4个异构体的AUC值超过0.90,表现出较高的诊断准确度。另外,这些异构体还被用于胰腺癌早期诊断研究。与数据归一化不同,本文将d0/d5-苯甲酰氯和甲胺化共衍生策略用于N-聚糖定量分析,更直观地展现N-聚糖的变化。利用微波辅助快速酶切实现糖胺的快速释放,有效缩短了分析流程。此外,天然酸性N-聚糖在MALDI-MS中会发生源内或源后裂解,而甲胺化不仅能稳固唾液酸,还能提高N-聚糖的信号响应,进而实现中性糖和酸性糖的同时定量分析。以不同的摩尔比对核糖核酸酶B(RNase B)N-聚糖进行分析,其线性相关系数均超过了0.9992,展现了良好的线性定量能力。将该方法用于骨髓瘤患者血清N-聚糖分析,筛选出5个可用于早期诊断的特异性N-聚糖标志物。在上述基础上,将nano LC-ESI-MS用于双衍生修饰的N-聚糖异构体的定量分析。通过对标准品N-聚糖进行分析,实现中性糖和酸性糖异构体的有效分离。而结合特异性α2-3糖苷外切酶,实现N-聚糖异构体唾液酸连接类型的有效识别。该方法还被用于同一骨髓瘤患者不同给药阶段血清N-聚糖异构体的分析,为药效预判提供了特异性N-聚糖标志物。以上试剂是不具备荧光基团的,本文建立了一种基于9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc N-hydroxysuccinimide ester,Fmoc-OSu)的N-聚糖分析方法,较为便捷地为N-聚糖提供了荧光标签。通过微波辅助快速酶切,有效防止了糖胺的水解。此外,Fmoc基团的引入显著提高了N-聚糖的信号响应,有助于低丰度N-聚糖的检测。值得说明的是,通过对Fmoc基团进行有效释放,成功制备出较高纯度的N-聚糖标准品。另外,该方法还被用于早期肺癌特异性N-聚糖标志物的筛选。综上,本文从糖组成和异构体角度对N-聚糖进行了定性定量研究。甲胺化有效稳固了唾液酸基团,进而使中性糖和酸性糖的同时定量分析成为可能。此外,不仅对酸性N-聚糖异构体上唾液酸的连接类型进行了有效解析,还成功制备出N-聚糖标准品。另外,对癌症血清样本的分析为特异性N-聚糖标志物的探寻提供了应用前景。