研究目的:为了进一步探讨中医药对于流行性感冒的有效性和作用机制,本研究建立了 H1N1流感病毒FM1株感染小鼠模型,以具有岭南特色的岗藿抗感汤为方,从细胞学、分子生物学和病理学等角度研究,观察岗藿抗感汤对病毒感染模型小鼠肺指数、死亡保护、湿干重比例、血气分析、病毒载量、肺组织形态学的变化,以及血清细胞因子含量及肺泡灌洗液中炎症细胞计数和分类的影响等的含量,进而探讨岗藿抗感汤抗流感的药效作用机制,为中医药治疗流感提供有效可靠的实验理论依据。研究方法:实验一流感病毒FM1株感染小鼠LD50的测定KM种小鼠91只,体重13.0-15.0g。随机分为7组,每组13只。在乙醚轻度麻醉下,选用7个病毒滴度的流感病毒液,滴鼻感染小鼠,每鼠4滴,约0.05ml以死亡和生存为观察指标,24h内死亡的不予统计。每天观察,记录小鼠死亡情况,直至感染后第15天为止。数据处理后用Reed—Muench两氏法,计算出病毒的半数致死量(LD50)。实验二岗藿抗感汤对流感病毒感染小鼠死亡保护研究KM小鼠50只,13-15g,雌雄各半。将KM小鼠随机分为正常组、模型组、利巴韦林组、岗藿抗感汤高剂量组、岗藿抗感汤低剂量组,共5组,每组10只,在乙醚轻度麻醉下,除正常组外,其余各组采用10LD5oH1N1病毒液滴鼻感染小鼠造模,正常组以等体积的无菌生理盐水滴鼻。感染4h后各组开始分别给药,各组给药体积均为0.2mL/10g,连续给药15天,观察小鼠一般状态,对小鼠的活动度、精神状况、气喘、有无咳嗽、皮毛光泽、体重变化等情况进行记录,并记录其生存天数,从而计算死亡保护率和延长生命率。实验三岗藿抗感汤对流感病毒感染小鼠的药效作用机制1 KM小鼠30只,13-15g,雌雄各半。随机分为正常组、模型组、利巴韦林组、岗藿抗感汤高剂量组、岗藿抗感汤低剂量组,共5组,每组6只。除正常组外,其余各组采用10LD50H1N1病毒液滴鼻感染小鼠造模,正常组以等体积的无菌生理盐水滴鼻。感染4h后各组开始分别给药,各组给药体积均为0.2mL/l0g,连续给药5天后进行实验。2岗藿抗感汤对流感小鼠肺指数、湿干重比例的影响末次给药后30min,将小鼠称重后摘眼球放血处死,仰位固定于小鼠板上。经酒精消毒后打开胸腔取出全肺,肉眼观察肺部病变,记录肺部病变的程度,用生理盐水洗净,后用干净滤纸吸掉残余盐水,称量全肺湿重,后再测量左肺湿重,将左肺放于60℃烘箱中干燥72h,取出称量干重,计算肺指数及湿干重比例。3岗藿抗感汤对流感小鼠肺组织形态学的影响末次给药后30min,将小鼠称重后摘眼球放血处死,仰位固定于小鼠板上。经酒精消毒后打开胸腔取出右肺,肉眼观察肺部病变,记录肺部病变的程度,用生理盐水洗净,后用干净滤纸吸掉残余盐水。保存于装有4%的多聚甲醛溶液5ml的EP管中,固定24小时,用于HE染色。4岗藿抗感汤对流感病毒感染小鼠血气分析的影响末次给药后30min,将小鼠轻微麻醉,进行仰卧固定(注意确保小鼠呼吸不受影响),腹部经酒精消毒后,剪开腹部皮肤和肌肉,分离腹主动脉,用采血针采取肝素抗凝血0.4ml,注射器针头抽出后立即插入小橡皮塞内,用手轻轻搓动注射器,使肝素与血液充分混合。使用全自动血气分析仪立即测定血气指标。5岗藿抗感汤对流感小鼠肺病毒载量的影响末次给药后30min,将小鼠称重后摘眼球放血处死,仰位固定于小鼠板上。经酒精消毒后打开胸腔取出左肺,肉眼观察肺部病变,记录肺部病变的程度,用生理盐水洗净,后用干净滤纸吸掉残余盐水。取小鼠左肺肺组织样本(200-300mg),测定肺组织中病毒含量。6岗藿抗感汤对流感小鼠血清细胞因子含量及肺泡灌洗液中炎症细胞计数和分类的影响末次给药后30min,取各组小鼠,眼静脉丛取血1.5mL,按CBA试剂盒方法测定血清中IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α、MCP-1含量。取肺泡灌洗液测定炎症细胞计数和分类。研究结果:实验一流感病毒FM1株感染小鼠LD5。的测定各浓度病毒观察15天结束后,统计各组小鼠死亡数目,按Reed和Muench氏法计算LD50,结果LD50为每0.05ml病毒液中含有10-2.57浓度的病毒。实验二岗藿抗感汤对流感病毒感染小鼠死亡保护研究正常组和利巴韦林组小鼠无死亡,模型组有9只小鼠死亡,死亡天数在4-7天之间,第6天达到死亡高峰。岗藿抗感汤高剂量组有6只小鼠存活,平均存活天数与模型组比较有显着统计学差异(P<0.05),岗藿抗感汤低剂量组有4只小鼠存活,平均存活天数与模型组比较无统计学差异,但有延长存活时间的趋势。实验三岗藿抗感汤对流感病毒感染小鼠的药效作用机制1岗藿抗感汤对流感小鼠肺指数、湿干重比例的影响病毒感染小鼠后,小鼠肺指数和肺湿干重比明显升高。和模型组比较,利巴韦林组肺指数和肺湿干重比明显降低(P<0.01)。岗藿抗感汤高剂量组肺指数明显降低(P<0.01);岗藿抗感汤低剂量组肺指数降低,但无显着性差异。岗藿抗感汤高、低剂量组与正常组和模型组相比,能降低病毒感染小鼠肺湿干重比(P<0.01),表明岗藿抗感汤具有抑制炎性介质的生成和渗出的作用。2岗藿抗感汤对流感小鼠肺组织形态学的影响正常组肺细胞完整,肺细胞间隔小,无炎性介质渗出,淋巴细胞少。模型组肺泡壁明显增厚,炎性介质生出严重,肺泡间隔明显增厚,肺泡毛细血管扩张,淋巴细胞明显增多,并形成实变。利巴韦林组肺泡明显,细胞相对完整,炎性介质渗出少,肺细胞间隔增厚不明显。和模型组相比岗藿抗感汤高、低组小鼠肺组织的形态结构基本恢复,炎性介质渗出少,肺细胞间隔增厚少。3岗藿抗感汤对流感小鼠血气分析的影响血气分析表明,病毒感染后小鼠PCO2明显升高,PO2、SpO2明显降低。利巴韦林组小鼠PCO2降低,PO2、SO2升高,与正常组及模型组相比有显着性变化(P<0.01或P<0.05)。岗藿抗感汤高剂量组能明显降低病毒感染后小鼠的PCO2、升高PO2、SpO2,,与正常组、模型组比较有显着差异(P<0.01或P<0.05),而低剂量组也可降低PCO2、升高PO2、SpO2,但没有显着性差异,效果弱于高剂量组。4岗藿抗感汤对流感小鼠肺病毒载量的影响病毒感染小鼠后,肺组织中病毒含量显着升高。和模型组比较,利巴韦林组小鼠病毒载量明显降低(P<0.01);岗藿抗感汤高剂量组能明显降低病毒感染小鼠肺组织中的病毒含量(P<0.01);岗藿抗感汤低剂量组能降低病毒感染小鼠肺组织中的病毒含量,但无统计学差异。提示岗藿抗感汤能抑制病毒在小鼠肺中的扩增,有抑制病毒复制的功效,且岗藿抗感汤高剂量组效果优于低剂量组。5岗藿抗感汤对流感小鼠血清细胞因子含量及肺泡灌洗液中炎症细胞计数和分类的影响利巴韦林组均能降低促炎性因子的含量及提高抗炎性因子的含量,可降低白细胞总数、淋巴细胞百分数、中性粒细胞百分比及提高巨噬细胞百分比,且与正常组、模型组对比均有显着性变化,P<0.01或P<0.05。岗藿抗感汤高、低剂量组均能降低小鼠血清中IL-6、TNF-α、MCP-1等促炎因子的水平,升高IL-10、IFN-Y在血清中的浓度,而IL-12水平改变不大,和正常组相比差异显着,P<0.01或P<0.05;与模型组相比,除岗蕾抗感汤低剂量组降低IL-6和岗藿抗感汤高、低剂量组降低IL-12没有显着性变化外,岗蕾抗感汤高、低剂量组对各细胞因子的影响均有显着性变化,P<0.01或P<0.05。岗藿抗感汤高剂量组能明显降低病毒感染小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数、淋巴细胞百分数、中性粒细胞百分比(P<0.01或P<0.05),明显升高病毒感染小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞百分比(P<0.05);岗藿抗感汤低剂量组能明显降低病毒感染小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数和中性粒细胞百分比(P<0.01),也可降低淋巴细胞百分数和提高巨噬细胞百分比,但无统计学意义。研究结论:1经岗藿抗感汤干预之后,岗藿抗感汤高、低剂量组能明显改善病毒感染小鼠的生存状态,提高小鼠生活质量,延长小鼠存活时间,岗藿抗感汤高剂量组效果优于低剂量组。2岗藿抗感汤可抑制炎性介质的生成和渗出,降低病毒感染小鼠肺指数和湿干重比,减轻肺水肿,改善小鼠的呼吸功能,减轻病毒对肺组织的病理损伤,岗藿抗感汤高剂量组效果优于低剂量组。3岗藿抗感汤可直接抑制H1N1流感病毒的复制,降低病毒感染小鼠的病毒载量,高剂量岗藿抗感汤效果优于低剂量组。4岗藿抗感汤通过调节体内抗炎、促炎因子水平,促进IL-10、IFN-γ等抗炎细胞因子的分泌;抑制IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1等促炎因子的合成和分泌来调节病毒感染小鼠免疫损伤机制;同时可影响白细胞的分类和比例,抑制流感病毒引致的小鼠肺部炎性介质的生成和渗出,减轻病毒引致的小鼠肺部炎症而实现其体内抗病毒作用。岗藿抗感汤高剂量组效果优于低剂量组。