研究背景:骨骼不仅能够用来支持和保护身体,而且还能与肌肉协同进行相关的身体活动,例如移动、静止状态维持等。与此同时骨骼还能够进行造血活动,并储存一些矿物质(例如钙)[1,2]。尽管骨骼看似是静态组织,但实际上,它是不断破坏并重复吸收和形成的动态结构,这被称为“骨骼重塑”。造血干细胞分化成的破骨细胞主要负责骨吸收,而由骨髓间充质干细胞分化成的成骨细胞主要负责骨骼的形成[1-5]。这些细胞的分化和功能均通过激素和局部的细胞因子受到严格的调节和调控。在正常的骨骼中,骨骼的吸收与形成之间保持着平衡,并且骨骼的质量保持一个相对恒定的数值。但是在骨质疏松,类风湿性关节炎(RA)和牙周炎等炎性骨骼相关疾病中,人体内骨吸收能力超过了骨形成能力,因此失去了平衡,从而诱发或导致了某些相关疾病的产生。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,Lnc RNAs)是一群大于或等于200个核苷酸(nt),没有或者具有非常低蛋白编码牵制的RNA。在人类基因组中,已经鉴定出了14470个lnc RNA基因的15787个lnc RNA转录本[6,7]。长期以来,lnc RNA被认为是无生物学功能的RNA聚合酶II转录的副产物。但是,最近的研究发现,lnc RNA在调节核染色质结构和基因表达中起着至关重要的作用,并且也是某些疾病发生和发展的积极参与者[8-10]。目前国内外研究已经发现有一系列lnc RNAs确认参与成骨细胞分化和成熟过程的调控。尽管lnc RNA的最新进展十分迅速,但仍有大多数lnc RNA的功能仍不清楚。以往研究发现Runx2对于成骨分化过程及相关基因的调控是必不可少的[11-13]。Runx2是Runx家族的三个成员之一,具有共同的保守性Runt结构域,可促进与其他蛋白质的通讯[14-17]。这三个成员(Runx1,Runx2和Runx3)在骨骼发育中都起着举足轻重的作用[18-20]。Runx2的功能归因于其m RNA序列编码的蛋白质结构。Runx2的各种位点均有助于骨骼进行重塑,其每个独特的功能都基于它与其他蛋白质和DNA序列的相互作用。而lnc RNA与RUNX2的调控关系仍在研究调查之中。在本课题中,我们通过对成骨前体细胞MC3T3-E1和成骨细胞的lnc RNA建库测序,分析找出lnc RNA-Dnm3os是在成骨分化中表达量差异最大的长链非编码RNA。随后通过相关体外实验我们发现lnc RNA-Dnm3os能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞分化。于是我们设想抑制lnc RNA-Dnm3os是否能够促进成骨细胞分化和成熟。通过设计相关动物实验,我们进一步在体内发现,注射抑制lnc RNA-Dnm3os的干扰RNA能够促进骨折的愈合。最后我们进行相关的机制研究,发现抑制lnc RNA-Dnm3os能够促进RUNX2的蛋白表达。所以最后我们认为lnc RNA-Dnm3os通过抑制RUNX2的蛋白表达,从而抑制成骨细胞的分化和成熟,并进一步延迟骨折的愈合。目的:长链非编码RNA在心脑血管疾病,免疫系统疾病,骨骼代谢性疾病中均能发挥积极有效的作用,而lnc RNA-Dnm3os抑制成骨细胞成熟和分化以及骨骼形成的相关研究并未见报道。本课题通过设计细胞,动物等体内体外实验,重点聚焦于Lnc RNA-Dnm3os抑制成骨细胞分化和成熟的机制探讨,并对其相关机制进行研究。方法与结论:第一部分:成骨细胞分化异常的关键长链非编码RNA的筛选和鉴定方法:(1)培养成骨前体细胞系及经成骨诱导培养基培养后21天的成骨细胞,提取总的RNA,并进行全转录组测序分析。(2)收集成骨前体细胞系和成骨细胞总的RNA,通过逆转录,q PCR等检测其中关键lnc RNA的表达量,以及成骨标志分化基因的表达量。结果:利用全转录组测序分析筛选出lnc RNA Dnm3os在成骨细胞中的含量减少,且变化最大;并通过q RT-PCR发现lnc RNA Dnm3os分化成成骨细胞后,在细胞内含量显著下降,且具有统计学差异。结论:lnc RNA Dnm3os在成骨细胞的分化过程中起着关键的作用。第二部分:lnc RNA Dnm3os抑制MC3T3-E1细胞系向成骨细胞分化方法:(1)培养MC3T3-E1细胞系,并对其转染lnc RNA Dnm3os-si RNA,通过向成骨方向分化,以及茜素红染色观察其成骨细胞成熟情况。(2)并通过q PCR检测其中成骨相关标志性基因的表达量。(3)构建骨折小鼠模型,并随机分为2组,1组注射lnc RNA Dnm3os-si RNA,另一组则注射阴性对照的si RNA,并通过H-E染色,micro-CT等观察小鼠骨折恢复情况。结果:通过MC3T3-E1分化为成骨细胞后,进行茜素红染色,q PCR检测发现,转染lnc RNA Dnm3os的si RNA成骨细胞明显增多。在体外构建骨折小鼠模型,其中注射lnc RNA Dnm3os-si RNA的小鼠组相比对照组骨折明显愈合增快。在H-E染色和ALP染色也观察相同的现象。结论:lnc RNA Dnm3os在体外可以抑制成骨细胞的分化。注射lnc RNA Dnm3ossi RNA的骨折小鼠组愈合比对照更快。第三部分:lnc RNA Dnm3os抑制成骨细胞分化和成熟的机制研究方法:(1)提取注射lnc RNA Dnm3os–si RNA小鼠中的BMSC,并进行成骨分化为成骨细胞。茜素红染色观察其形态和钙沉积(2)通过蛋白质印记实验(WB),观察其中成骨相关蛋白的表达水平变化(3)通过STARBASE数据库,发现与lnc RNA Dnm3os相竞争的mi RNA。(4)通过荧光素酶报告实验验证lnc RNA Dnm3os与mi R-328直接作用关系。(5)过表达或抑制mi R-328。观察MC3T3-E1向成骨方向分化时成骨细胞数量的变化结果:(1)观察原代细胞BMSC受lnc RNA Dnm3os-si RNA向成骨细胞方向分化的影响;(2)通过WB实验发现,体外转染lnc RNA Dnm3os–si RNA,RUNX2表达量增加。(3)通过STARBASE数据库,发现lnc RNA Dnm3os可能和mi R-328存在ce RNA竞争关系。(4)通过荧光酶素报告实验发现,lnc RNA Dnm3os和mi R-328存在直接竞争关系。(5)过表达mi R-328,促进MC3T3-E1向成骨方向分化,而抑制mi R-328,抑制MC3T3-E1向成骨方向分化。结论:(1)lnc RNA Dnm3os和mi R-328是内源性ce RNA;(2)lnc RNA Dnm3os通过竞争mi R-328结合从而抑制MC3T3-E1向成骨方向分化。