背景脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种高致残率的中枢神经系统创伤。近年兴起的组织工程学方法为SCI的治疗带来了新的思路，即通过种子细胞-支架材料-神经营养因子复合物的培养移植，从组织水平进行脊髓再生重构，以促进脊髓功能恢复。其中生物支架为种子细胞的粘附、生长和浸润提供适宜微环境和必要的机械支撑，在脊髓的组织工程修复中发挥重要作用。常用的脊髓支架材料多为可降解天然或合成高分子生物材料，如：胶原、壳聚糖、PLGA等。它们共同的问题在于难以模仿脊髓复杂的三维网状结构，因此极大地限制了其在脊髓修复重建中的应用。近年来多种用天然的脱细胞基质(acellular extracellularmatrix, AECM)被报道用于组织工程支架材料研究，这类材料去除了组织内细胞成分，保留了细胞外基质(extracellular matrix, ECM)及其三维结构，为种子细胞的粘附、增殖、迁移、分化以及血管生长提供框架结构，能够无排斥的移植，并被宿主完全替代，已成功用于皮肤、膀胱、小肠、心瓣膜、血管、骨骼肌及外周神经等。课题组在前期研究中尝试将大鼠脊髓进行脱细胞处理，希望去除脊髓内的细胞及髓鞘成分，保留胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等ECM及其三维空间结构，构建一种符合脊髓生理需要和解剖结构的新型生物支架。但前期的脊髓脱细胞方法尚不完善，容易破坏脊髓ECM的三维空间结构并出现细胞残留，所构建的支架还存在生物力学强度低、抗酶解能力弱、结构稳定性差等不足。本课题拟在前期工作基础上优化脱细胞脊髓支架的制备方法，制备出脱细胞彻底且ECM结构完整的大鼠脱细胞脊髓支架；通过京尼平化学交联对大鼠脱细胞脊髓支架进行改性处理，增强其生物力学性能、抗酶解能力及结构稳定性；探讨改性优化的大鼠脱细胞脊髓支架的生物相容性及其对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)生物学特性的影响，为SCI修复的组织工程研究提供一种可供选择的新型生物支架。目的1.改良大鼠脱细胞脊髓支架的制备方法，使其既能较彻底地去除脊髓内的细胞、髓鞘等免疫原性成分，又能较完整地保留脊髓ECM的天然三维空间结构。2.建立较高纯度大鼠BMSCs的体外分离培养方法，研究其成骨、成脂、成神经的多向分化潜能，为SCI修复提供一种较理想的种子细胞。3.探讨京尼平化学交联改性对大鼠脱细胞脊髓支架的生物力学性能、抗酶解能力、结构稳定性等理化特性和生物相容性的影响，为SCI修复的组织工程研究提供一种可供选择的新型生物支架。方法1.分别以改良方法和旧方法制备大鼠脱细胞脊髓支架，采用肉眼观察、光镜、扫描电镜、DNA检测试剂盒、琼脂糖凝胶电泳等技术对比研究支架的大体形态、显微结构、优良率、DNA残留量、孔隙率、含水率、酶解率等特性。2.采用密度梯度离心结合差速贴壁法在体外分离、培养大鼠BMSCs，采用MTT法检测细胞的增殖活力，以流式细胞仪检测鉴定细胞表面标志物表达情况，将细胞行成骨、成脂、成神经诱导分化后，分别行茜素红染、碱性磷酸酶染色、油红O染色和NSE、GFAP免疫荧光染色，检测其多向分化潜能。3.分别采用京尼平和戊二醛对大鼠脱细胞脊髓支架进行化学交联改性，采用肉眼观察、光镜、扫描电镜、生物力学测试仪等技术对比研究改性支架的大体形态、显微结构、孔隙率、含水率、酶解率、结构稳定性及生物力学性能。4.将大鼠BMSCs接种到未交联组、京尼平交联组和戊二醛交联组大鼠脱细胞脊髓支架后进行体外培养，采用MTT法、光镜、电镜等技术对比研究三组支架的细胞毒性、细胞粘附能力及细胞在支架上的生长、迁移等生物学行为。5.将正常脊髓、未交联组、京尼平交联组及戊二醛交联组大鼠脱细胞脊髓支架植入同种异体大鼠皮下，通过HE染色、CD4及CD8免疫组化染色对比研究各组支架在体内的炎症反应、吸收过程及免疫原性情况。结果1.改良方法制备的大鼠脱细胞脊髓支架脱细胞更彻底，ECM三维结构保存更完整，优良率为65%，DNA残留量为35.7±18.5ng/mg干重，优于旧方法；孔径范围为10~100μm，孔隙率为85.9±6.3%，含水率为284.1±12.7%，但体外酶解速度较快，与旧方法相当。2.采密度梯度离心结合差速贴壁法培养的大鼠BMSCs具有典型的成纤维细胞样梭形形态，纯度约98%，增殖旺盛，表达CD44、CD90分子，不表达CD34和CD45分子，具有成骨、成脂、成神经多向分化潜能。3.与交联前相比，京尼平交联的大鼠脱细胞脊髓支架极限牵张应力和弹性模量分别由0.112±0.071MPa、0.564±0.113MPa提高到0.193±0.064MPa、1.541±0.082MPa，抗酶解能力和在PBS中的稳定性显著增强，大体形态、显微结构、孔隙率、孔径基本维持不变，含水率略下降为229.7±12.5%，上述结果与戊二醛交联组基本一致。4.京尼平交联组和未交联组支架细胞粘附能力较强，细胞相对生长率近100%，细胞毒性评级为0~1级，无明显细胞毒性，大鼠BMSCs可在支架上正常生长、迁移、分泌ECM，优于戊二醛交联组。5.京尼平交联支架移植到同种异体大鼠体内，仅有轻微的异物反应，体内吸收时间较未交联支架明显延长，免疫原性极其微弱，与戊二醛交联支架相当，明显优于未交联支架。结论1.成功改良了大鼠脱细胞脊髓支架的制备方法，该改良方法可较彻底地去除脊髓内的细胞及髓鞘成分，并较完整地保留脊髓ECM的天然三维空间结构，优于原有制备方法。2.采用密度梯度离心结合差速贴壁法可分离培养出纯度较高的大鼠BMSCs，该细胞增殖旺盛，具有成骨、成脂、成神经的多向分化潜能，是一种可用于SCI修复的种子细胞。3.京尼平交联改性的大鼠脱细胞脊髓支架具有与正常脊髓相似的大体形态、天然的三维空间结构以及良好的孔隙率和含水率，其生物力学性能、抗酶解能力及结构稳定性得到明显增强。4.京尼平交联改性的大鼠脱细胞脊髓支架具有良好的细胞相容性和组织相容性，免疫原性极低，体内吸收时间较交联前明显延长，显示出良好的生物相容性，为SCI修复的组织工程研究提供一种可供选择的新型生物支架。