论文部分内容阅读
香樟齿喙象Pagiophloeus tsushimanus是2014年首次报道的中国新纪录蛀干害虫,目前上海市各行政区的香樟林已受到该虫的严重为害,且存在扩散蔓延的趋势。由于该虫的幼虫期都“潜伏”在香樟树干里,具有活动隐蔽、破坏性强及防治难度大等特点,严重影响了香樟的正常生长。对于有效防控香樟齿喙象的技术尚未见相关研究报道,尤其是基于引诱剂的监测防控技术。香樟齿喙象的寄主植物为香樟Cinnamomum camphora,然而前期观察发现该虫在樟科植物浙江桂C.chekiangensis与浙江楠Phoebe chekiangensis上也能完成生活史。浙江桂与浙江楠是城市绿化的重要树种,为探究香樟齿喙象的寄主选择偏嗜性,本文开展了香樟齿喙象成虫对香樟、浙江桂与浙江楠的嗅觉选择性研究。调控昆虫嗅觉通讯的挥发性信息化学物质包括寄主植物挥发物与昆虫信息素,为明确挥发物在调控成虫种内和种间化学通讯过程中的嗅觉信号作用,并揭示成虫嗅觉选择的生理和分子机制,本文依据化学生态学理论,以嗅觉化学通讯为主线,利用昆虫行为学、昆虫生理学、触角电生理、分析化学与分子生物学等技术方法,分离鉴定了寄主植物和虫体的挥发物关键组分,并检测了关键组分的生物活性,为开发香樟齿喙象的引诱剂提供依据;同时探究了成虫气味结合蛋白基因（PtsuOBPs）的组织表达特性及其关键气味结合蛋白（PtsuOBPs）结合气味分子的功能,从分子生物学的角度进一步验证了挥发性信息化学物质活性组分的鉴定结果,为深入揭示香樟齿喙象的嗅觉感受机制奠定基础。主要研究结果如下:1、采用选择试验、非选择试验及“Y”型嗅觉仪法检测发现,香樟齿喙象雌、雄成虫偏嗜在香樟枝条上取食;雌成虫偏嗜在香樟枝条上产卵;雌、雄成虫对香樟的挥发物具有正趋性的行为反应,而对浙江桂或浙江楠的挥发物具有负趋性的行为反应。综上表明,雌、雄成虫对香樟的挥发物具有选择偏嗜性,研究结果可为香樟齿喙象发生寄主转移的监测防控提供参考依据。2、采用动态顶空吸附、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）与标样内标及保留指数比对等技术,鉴定发现,香樟、浙江桂与浙江楠三种樟科植物存在较多的挥发物差异组分。为明确诱发香樟齿喙象成虫对寄主植物香樟的选择偏嗜性的挥发物关键组分,选用气相色谱-触角电位联用仪（GC-EAD）、GC-MS、触角电位仪（EAG）与生物活性检测等方法,鉴定发现,樟脑（D（+）-Camphor）是成虫识别香樟的挥发物活性组分。香樟挥发物中,樟脑与罗勒烯均能引起雌、雄成虫的触角GC-EAD反应,且EAG反应强于其它挥发物组分。樟脑诱芯对雌、雄成虫均具有引诱活性,5 mg/m L浓度的樟脑诱芯的林间诱捕效果较好,诱集的雌、雄成虫数量无显著差异。罗勒烯与溶剂对照组（CK异丙醇）均未诱捕到成虫,表明罗勒烯不具有引诱活性。罗勒烯对樟脑不具有增效作用。适合应用于林间诱捕该虫的装置为桶型诱捕器（自制）。樟脑在香樟挥发物中的相对含量显著高于浙江桂与浙江楠,而罗勒烯在三种樟科植物挥发物中的相对含量无显著差异,进一步表明樟脑是诱发成虫偏嗜选择香樟的主要因素之一。综上表明,樟脑是香樟齿喙象成虫识别寄主植物香樟的关键嗅觉信号物质,基于樟脑配制的植物源引诱剂可被应用于林间诱捕监测该害虫。3、采用多种化学生态学方法鉴定发现,（1α,3α,4α,6α）-4,7,7-三甲基双环[4.1.0]庚烷-3-醇是香樟齿喙象雌、雄成虫种内化学通讯的信息素组分,由雄成虫释放。挥发物组分中具有GC-EAD反应的樟脑与右旋龙脑是来源于成虫体壁残留物或虫粪挥发的寄主植物香樟的挥发物组分。雌、雄成虫对三甲基双环庚烷3醇具有触角GC-EAD反应,且EAG反应较强。三甲基双环庚烷3醇对雌、雄成虫均具有引诱活性,林间诱捕效果较好的浓度是0.5mg/m L,诱集的雌、雄成虫数量无显著差异;同时测定了右旋龙脑的生物活性,结果发现右旋龙脑与溶剂对照组（CK异丙醇）均未诱捕到成虫,表明右旋龙脑不具有引诱活性。香樟挥发物各组分对信息素组分三甲基双环庚烷3醇均不具有增效作用。综上表明,（1α,3α,4α,6α）-4,7,7-三甲基双环[4.1.0]庚烷-3-醇是雌、雄成虫种内化学通讯的关键嗅觉信号物质,基于三甲基双环庚烷3醇配制的信息素引诱剂可对该害虫进行林间监测。4、利用Illumina Hiseq TM2000技术平台对香樟齿喙象雌、雄成虫进行转录组测序,组装获得了58088条Unigenes,其中29824条Unigenes被成功注释。基于数据库同源比对以及生物信息学分析,克隆了39条香樟齿喙象成虫气味结合蛋白基因（PtsuOBPs）,命名为PtsuOBP1-39。39条PtsuOBPs的编码序列均具有典型的昆虫OBP结构特征,即包含4-6个保守的半胱氨酸位点。系统进化分析发现,PtsuOBPs与其它鞘翅目昆虫OBPs之间的氨基酸序列存在高度的氨基酸序列保守性,表明PtsuOBPs在进化上比较保守。利用q RT-PCR技术分析发现,大部分PtsuOBPs在雌、雄成虫触角组织中的相对表达量显著高于其它组织。基于樟脑与三甲基双环庚烷3醇诱导的关键PtsuOBPs基因筛选发现,樟脑可诱导雌、雄成虫的PtsuOBP7、PtsuOBP16、PtsuOBP24、PtsuOBP33与PtsuOBP39等5条PtsuOBPs基因的表达量上调,而三甲基双环庚烷3醇可诱导雌、雄成虫PtsuOBP4、PtsuOBP11、PtsuOBP16、PtsuOBP26与PtsuOBP39等5条PtsuOBPs基因的表达量上调。筛选获得了关键的PtsuOBPs基因,为气味结合蛋白（PtsuOBPs）的功能分析奠定了基础。5、采用原核表达与镍离子树脂重力柱纯化法表达并纯化PtsuOBPs,获得了PtsuOBP7、PtsuOBP11、PtsuOBP16、PtsuOBP24、PtsuOBP33与PtsuOBP39等6个关键的气味结合蛋白。利用荧光竞争性结合法测定PtsuOBPs的结合力发现,与寄主植物挥发物樟脑的荧光竞争性结合力最强为气味结合蛋白PtsuOBP33（Ki=6.24μM）,而与成虫信息素三甲基双环庚烷3醇的荧光竞争性结合力最强为PtsuOBP39（Ki=1.11μM）。进一步采用同源建模、分子对接预测以及重叠延伸PCR定点突变技术等方法进一步验证PtsuOBP33结合樟脑和PtsuOBP39结合三甲基双环庚烷3醇的主要结合作用类型和功能位点,结果表明,PtsuOBP33主要以谷氨酰胺（Gln94）残基与气味分子之间形成的氢键作用结合樟脑,而PtsuOBP39主要通过氢键与疏水作用等两种作用类型结合三甲基双环庚烷3醇,氢键作用位点为赖氨酸（Lys54）残基,疏水作用位点为甲硫氨酸（Met89）残基。综上表明,分别存在对樟脑与三甲基双环庚烷3醇结合力强的香樟齿喙象成虫气味结合蛋白（PtsuOBPs）,进一步验证并支持了成虫种内与种间化学通讯的挥发物活性组分的鉴定结果。综合分子生物学与化学生态学鉴定结果的正反向相互验证,最终明确了香樟齿喙象成虫种内与种间化学通讯的挥发性信息化学物质的活性组分,即樟脑是成虫识别寄主植物香樟的关键嗅觉信号物质,（1α,3α,4α,6α）-4,7,7-三甲基双环[4.1.0]庚烷-3-醇是雌、雄成虫种内化学通讯的信息素活性组分。