我国纳米ZnO的生产规模每年已经超过1万吨。随着纳米ZnO的广泛应用,纳米ZnO在生产、运输、使用等过程中将不可避免的通过各种途径进入土壤生态系统,长期累积达到一定浓度水平后对土壤-植物系统会产生怎样的影响?目前尚不清楚。锌是植物生长发育必需的营养元素,但过量会对植物造成毒害,因此,有必要研究纳米ZnO在土壤中对植物的生物效应。纳米ZnO因具有良好的抗菌性能,对多种微生物都具有毒性作用;丛枝菌根(AM)真菌是广泛存在于土壤中的微生物,它既能帮助植物获得营养、促进植物生长,还存在对重金属耐受性的潜在机制,避免重金属在植物体内的过量累积。当过量纳米ZnO进入土壤生态系统后,AM真菌与纳米ZnO对植物生长发育具有怎样的互作效应?AM真菌能否缓解高浓度纳米ZnO对植物的生长胁迫?其缓解机理是什么?迄今未见相关的研究报道。本文首先采用土培试验,研究了(1)不同浓度纳米ZnO对玉米的生物效应,明确了纳米ZnO对玉米产生刺激/毒害的浓度水平,并从营养生理角度分析了高浓度纳米ZnO对玉米生长毒害的机理。(2)纳米ZnO与AM真菌交互作用对玉米的生物效应,并从营养生理角度分析了AM真菌缓解纳米ZnO植物毒害的机理;(3)通过对玉米叶片和根细胞的超微结构观测,以及基因表达测定,分别从亚细胞水平和分子水平探讨了高浓度纳米ZnO对玉米的毒害机理以及AM真菌的缓解机制;最后,结合有机肥,探讨了有机肥和AM真菌协同对纳米ZnO植物毒害效应的调控。主要研究结果如下:1.纳米ZnO对玉米的生物效应在土壤盆栽条件下,研究了不同浓度纳米ZnO(0、100、200、400、800、1600、3200 mg/kg)对玉米的生物效应及其在土壤中的生物有效性。结果表明:(1)纳米ZnO在0-3200 mg/kg浓度范围内,对玉米产生了从刺激到中性再到毒性的作用。当纳米ZnO<400 mg/kg时,促进玉米生长,≥800 mg/kg时毒害玉米的生长,且毒害作用随纳米ZnO浓度的增加而加强。(2)纳米ZnO与ZnSO4一样具有较高的生物有效性,在土壤中能释放出Zn2+或其它可交换态锌被作物吸收利用。(3)高浓度的纳米ZnO通过以下几种方式对玉米的生长发育造成毒害:①抑制玉米根系的生长,降低玉米的根系活力,减少玉米植株的矿质元素吸收;②降低玉米叶片的光合色素含量,影响玉米的正常光合作用,从而抑制玉米的生长;③诱导玉米植株细胞内的活性氧自由基(ROS)含量的增加,超出植物体内抗氧化体系的应激能力,从而对植物的细胞造成过氧化损伤;④增加玉米植株体内的锌浓度,超出植物自身对锌的需求,从而造成植物毒害。2.AM真菌能缓解纳米ZnO对玉米的生物胁迫在温室培养条件下,研究了地表球囊霉(Glomus versiforme)和苏格兰球囊霉(Glomus caledonium)2种AM真菌对纳米ZnO胁迫下(400、800、1600、3200 mg/kg)玉米生长发育的影响。结果发现:(1)高剂量的纳米ZnO(>400 mg/kg)对土壤中的AM真菌具有毒害效应,并且随着纳米ZnO剂量的加大,毒害效应加强,AM真菌对玉米根系的侵染率显著下降。(2)两种AM真菌对纳米ZnO的毒害作用均具有较好的忍耐性,在3200 mg/kg的纳米ZnO剂量下,仍然能较好的侵染玉米根系(侵染率>40%),且后者忍耐性更强。(3)两种AM真菌均能能有效缓解高浓度纳米ZnO胁迫引起的玉米生长不良效应。接种AM真菌增加了玉米叶绿素含量、抗氧化体系酶活性,促进了玉米对N、P、K、Ca、Mg、Fe的吸收,显著降低玉米对Zn的吸收及向地上部的转运,避免了过量Zn在地上部的富集,从而有效缓解了纳米ZnO的生物胁迫,显著促进了玉米的生长发育。(4)AM真菌可通过以下几种机制缓解纳米ZnO的植物毒害效应:①诱导植物体内超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化体系酶活性的增加,减少细胞的脂质过氧化,降低细胞的过氧化损伤。②促进植物生长,增加生物量,对植物体内锌元素产生“稀释效应”,降低植物体内的锌浓度,减轻纳米ZnO对植物的毒害效应。③把较多的锌固定在根系,减少锌由根系向地上部的运输,调整锌在根系和地上部的分配比率,降低锌在植物地上部的累积,降低纳米ZnO毒害作用。④形成的菌根向土壤中分泌了一定数量的GRSP,GRSP可能与一部分Zn相结合,起到了固持作用,降低纳米ZnO生物有效性。3.纳米ZnO与AM真菌对玉米细胞结构的影响在纳米ZnO胁迫(1600 mg/kg)和接种AM真菌(Glomus versiforme)条件下,利用透射电镜和能谱分析法,从亚细胞水平研究了纳米ZnO和AM真菌对玉米细胞超微结构的影响。结果发现:(1)高浓度纳米ZnO胁迫下,玉米叶片细胞和根细胞结构均遭到严重损伤:叶片细胞部分破碎,细胞壁扭曲变形破裂,细胞核、线粒体肿胀,叶绿体及内部基粒片层破碎降解;根细胞出现严重的质壁分离现象,细胞壁、液泡扭曲变形,细胞质凝聚成团。(2)接种AM真菌显著降低了玉米叶片细胞和根细胞结构的损伤程度:玉米叶片细胞较完整没有破碎,细胞壁变薄没有断裂,叶绿体肿胀变形但没破碎;根细胞质壁分离现象减轻,细胞壁仅轻微扭曲变形,线粒体仅轻微膨胀,能看到细胞质里面分布的一些细胞器。(3)高浓度纳米ZnO胁迫下,玉米体内Zn浓度显著增加,并且在玉米叶片和根细胞内观测到大量纳米ZnO颗粒,这一方面破坏了玉米叶片细胞的超微结构,损害叶片细胞内的叶绿体,使叶绿素含量降低,从而使光合作用下降,光合产物减少;另一方面破坏玉米根细胞,减少了玉米植株对水分和矿质营养元素的吸收;二者共同抑制了玉米植株的生长发育,造成植物毒害,这是纳米ZnO产生植物毒害的一个重要机制。(4)高浓度纳米ZnO胁迫下,接种AM真菌,降低了植株体内Zn浓度,减轻了纳米ZnO对玉米叶片细胞和根细胞超微结构的损伤,使叶片细胞内的叶绿体相对完整,叶绿素含量升高,从而使光合作用增强;增强了根系活力,增加了根系对水分和矿质营养元素的吸收,从而效缓解了纳米ZnO对玉米的毒害,这是AM真菌缓解纳米ZnO生物胁迫重要机制。4.基于转录组测序技术的纳米ZnO与AM真菌对玉米基因表达谱的影响本研究利用1CK(正常生长)、2CKM(正常生长接种AM真菌)、3n ZnO(1600 mg/kg纳米ZnO胁迫)、4 n ZnOM(1600 mg/kg纳米ZnO胁迫下接种AM真菌)4个处理,采用RNA-Seq技术分析了纳米ZnO和AM真菌对玉米叶片中基因表达差异的情况,结果表明:(1)通过基因表达注释和转录组比较分析,共筛选出3486条在纳米ZnO胁迫后发生差异表达的基因,其中2111条表达上调,1375条表达下调。共筛选到1477条在纳米ZnO胁迫下接种AM真菌后发生差异表达的基因,其中592条表达上调,885条表达下调。(2)纳米ZnO胁迫下,玉米的差异表达基因主要集中在几个主要的生物学途径:“代谢通路”、“次生代谢物的生物合成”和“光合作用天线蛋白”等,这些途径受到纳米ZnO的影响最为明显,因此可能是胁迫玉米生长的主要生理原因。(3)接种AM真菌后,发生变化的一些代谢途径与纳米ZnO胁迫比较一致,但在这些生物学途径中表达的差异基因数量明显减少了,因此AM真菌可以缓解纳米ZnO对这些生物学途径的损伤,从而缓解纳米ZnO对玉米的胁迫效应。5.有机肥与AM真菌协同对纳米ZnO植物毒害效应的调控利用土壤盆栽法,研究了在纳米ZnO胁迫下(1600 mg/kg),施用有机肥(0、1%、5%、10%)、有机肥+接种AM真菌对玉米生长发育的影响。结果表明:(1)有机肥、有机肥+AM真菌均可有效缓解纳米ZnO的植物毒性,且有机肥+AM真菌的协同作用效果优于单施有机肥。(2)高浓度纳米ZnO胁迫下,施用有机肥降低了玉米对Zn的吸收,能有效缓解纳米ZnO对植物的毒害;有机肥+AM真菌减少了Zn由根系向地上部的转运,调节了Zn元素在玉米地上部和根系的分配,缓解了过量纳米ZnO的毒害。