耐药是临床治愈白血病的一个主要障碍。肿瘤耐药是一种多因子共同作用导致的现象,尽管发现药物灭活,药物外排,存活通路激活,凋亡机制缺陷等与耐药有关,但是耐药的决定性因素尚不清楚。近来,大量的研究发现microRNA在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。其中,部分microRNA通过影响特定的信号通路影响肿瘤对化疗药物的敏感性。因此,microRNA在耐药形成中的作用日益受到学者们的关注。MiR-21是第一个在人类基因组中发现的microRNA,并且是唯一在所有恶性肿瘤均高表达的microRNA。MiR-21被发现与肿瘤的诊断标志和预后标志显著相关,因此其可能成为恶性肿瘤诊断和预后判断的生物学标记。此外,异常表达的miR-21可以预测肿瘤对传统化疗药物,如吉西他滨,多西他赛,替莫唑胺,5-氟尿嘧啶等的反应。最近,几项研究探讨了miR-21在髓细胞白血病和淋巴细胞白血病耐药中的作用。研究发现,miR-21反义寡核苷酸提高三氧化二砷对急性髓细胞白血病细胞的毒性。抑制miR-21,增强三氧化二砷和阿糖胞苷诱导的慢性髓细胞白血病细胞的凋亡。MiR-21的这些作用,部分是通过影响PDCD4表达行成的。雷公藤甲素是1972年首次从雷公藤根部提取的二萜类化合物,现在已经开发了人工合成的工艺。文献报道,雷公藤甲素具有抗炎,免疫抑制,抗生育和抗肿瘤作用。大量研究发现,雷公藤甲素在体外能够抑制多种肿瘤的增殖,诱导肿瘤的凋亡；在体内,雷公藤甲素可以抑制肿瘤生长和转移。研究证实,雷公藤甲素可以抑制细胞周期和细胞存活相关蛋白,包括cyclins D1, B1, and A1, Cdc-25; Bcl-X和c-Jun。雷公藤甲素还降低抗凋亡蛋白如XIAP, Bcl-2和Mcl-1等的表达。在白血病和卵巢癌细胞中,雷公藤甲素诱导caspase依赖的凋亡；在胰腺癌中,雷公藤甲素诱导caspase非依赖的自噬性死亡。研究目的：本研究的目的是观察雷公藤甲素是否通过miR-21影响白血病细胞对化疗药物阿霉素的敏感性,并且探讨其可能的分子机制。研究方法：(1)雷公藤甲素的毒性和耐药逆转作用采用MTT实验。(2)miR-21的表达采用SYBR green PCR方法。(3) NF-κB的活性采用EMSA方法检测。NF-κB与miR-21基因启动子区域结合采用ChIP方法。(4)miR-21模拟物和抑制物由化学合成,并且转染入K562细胞或K562/A02细胞。(5) P65, T-AKT, P-AKT, PTEN, BCL-2蛋白水平采用western blot检测。(6)细胞凋亡率采用流式细胞仪检测Annexin V/PI染色细胞。(7)流式细胞仪检测P糖蛋白表达。P糖蛋白功能检测采用罗丹明-123蓄积实验。(8)本研究假设,在K562细胞中,PTEN是miR-21的一个直接靶基因。为验证此假说,K562细胞共转染PTEN-3’非编码序列荧光素酶报告基因和miR-21.(9)为了探讨PTEN与阿霉素毒性的关系,PTEN siRNA被转染入K562细胞,接着采用一系列浓度的阿霉素作用。(10) P65, PTEN mRNA水平采用SYBR green PCR.方法检测。研究结果：(1)因为耐药逆转剂需要采用对受试细胞无抑制或无毒性的浓度,雷公藤毒性试验结果提示,5 nmol/L雷公藤甲素被用于后续耐药逆转试验。(2)雷公藤甲素降低miR-21在K562/A02细胞的表达水平。P65 mRNA水平和蛋白水平,以及P65转录活性,在雷公藤甲素作用后明显下降。(3) ChIP试验和EMSA试验均证明NF-κB能够与miR-21启动子区域结合。ChIP试验进一步证明,K562/A02细胞经雷公藤甲素作用后,NF-κB与miR-21启动子结合明显下降。(4) 5 nmol/L雷公藤甲素提高K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。3μg/mL阿霉素诱导的K562/A02细胞凋亡率为4.3%,当与5 nmol/L雷公藤甲素联合应用时,凋亡率上升到18.5%。(5)雷公藤甲素明显抑制P糖蛋白在K562/A02细胞的表达。罗丹明-123蓄积试验表明,雷公藤甲素能够抑制P糖蛋白功能。(6)K562细胞转染miR-21模拟物后,miR-21水平明显上升；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,miR-21水平明显下降。K562细胞转染miR-21模拟物后,存活率明显升高；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,存活率明显下降。(7)K562细胞转染miR-21模拟物后,PTEN蛋白水平明显下降；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,PTEN蛋白水平明显上升。MiR-21降低K562细胞PTEN-3’非编码序列荧光素酶报告基因活性。(8)PTEN siRNA显著降低K562细胞PTEN蛋白水平。K562细胞转染PTEN siRNA后,细胞存活率升高,而且P糖蛋白的表达升高。(9)雷公藤甲素能够有效抑制BCL-2在K562/A02细胞的表达。K562细胞转染miR-21模拟物后,BCL-2表达水平明显上升；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后,BCL-2表达水平明显下降。结论：(1)雷公藤甲素提高K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。(2)雷公藤甲素抑制miR-21在K562/A02细胞的表达,从而升高PTEN蛋白水平。(3)雷公藤甲素通过PTEN/AKT通路抑制P糖蛋白表达和功能。(4)雷公藤甲素通过调节miR-21水平,抑制BCL-2在K562/A02细胞的表达,提高阿霉素诱导的细胞凋亡。