桑树是一种多年生的木本经济作物,不仅作为家蚕的饲料被大面积种植,其果实桑椹,风味独特,营养丰富,深受人们欢迎。桑树还能适应很多逆境胁迫,如寒冷、水淹、干旱以及盐碱环境。随着蚕桑产业的发展,桑树的商业应用前景越来越广阔。乙烯是一种结构简单的植物气体激素,在植物整个生命周期中调控多种生长发育和胁迫应激反应,ACO是乙烯生物合成途径中的关键酶,能催化ACC形成乙烯。启动子在基因表达调控方面起着至关重要的作用,探索启动子功能与基因表达之间的关系有助于通过基因工程手段调控基因表达。目前有关桑树ACO基因的研究主要集中在其转录表达层面,对其启动子的功能还未知。本研究对川桑MnACO启动子序列进行克隆以及生物信息学分析,构建植物表达载体并转化拟南芥,对阳性转基因植株进行非生物胁迫处理及GUS组织化学分析,探究ACO基因及其启动子在桑树生长发育和逆境中的作用,为改良桑树品种奠定分子生物学基础;并探索乙烯利和1-MCP对桑椹中Ma ACO2基因表达的影响,为桑树品种选育,改良桑椹品质及调节后熟进程提供理论依据。1.桑树MnACO启动子扩增与序列分析以川桑基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得的启动子序列分别为1518 bp和1429 bp。分析启动子序列,发现MnACO1和MnACO2启动子各含有1个转录起始位点,分别在起始密码子上游-101bp处和-106 bp处,且两者都有含有TATA-box,表明其具有启动子的核心启动元件,能启动基因正常转录。两者都含有响应外界环境刺激的TC-rich repeats和响应赤霉素的GARE-motif,含有响应外界热刺激的元件,MnACO1为MBS,而MnACO2为HSE。MnACO1含有响应植物激素的Aux RE元件,MnACO2含有响应水杨酸的TCA-element元件。结果表明MnACO1和MnACO2启动子具有启动子的一般特性和功能,能使植物在逆境环境中通过调节基因的表达抵御多种刺激。2.桑树MnACO启动子调控转基因拟南芥中GUS基因的表达将启动子片段与GUS报告基因连接,构建植物表达载体,并转化拟南芥,分别获得2株p MnACO1::GUS和4株p MnACO2::GUS转基因拟南芥。分析T3代转基因植株不同生长阶段的GUS活性,结果显示,p MnACO1::GUS植株生长发育的各时期均能检测到GUS活性,且较p MnACO2::GUS植株高;p MnACO2::GUS植株生长1周和2周时,根尖中GUS活性较叶片高,但生长至4周,根尖和莲座叶片没有检测到明显GUS活性,仅莲座叶丛的中心有少量GUS活性。p MnACO1::GUS植株的花瓣、花药、花丝以及柱头中有较高GUS活性,花柱和花序轴中的活性较低;p MnACO2::GUS植株的花瓣、花药、花丝、柱头和茎生叶中,能检测到GUS活性,但花柱和花序轴中无GUS活性。p MnACO1::GUS果柄以及果荚中有少量GUS活性,但p MnACO2::GUS的果柄和果荚中无GUS活性。结果表明,MnACO启动子在拟南芥不同生长阶段,其表达部位及表达活性不同,推测Ma ACO2具有组织特异性,与果实成熟密切相关,可能为果实特异性启动子,可利用其对桑椹品质进行改良。3.不同处理对桑树MnACO启动子及基因的影响MnACO1和MnACO2启动子对不同胁迫呈现不同的响应模式,且桑幼苗Ma ACO基因经处理后的表达趋势与转基因拟南芥GUS染液吸光值变化趋势一致。Na Cl处理后,MnACO启动子GUS染液吸收值随处理时间而增加。损伤处理上调p MnACO::GUS转基因植株中GUS基因的表达,12 h的GUS活性最高。p MnACO1::GUS植株经ABA处理3 h后染色最深,随后下降;p MnACO2::GUS植株经ABA处理后,24 h的GUS活性最高。SA处理后,p MnACO1::GUS和p MnACO2::GUS植株的GUS活性在24 h最高。Na Cl、ABA、SA以及损伤叶片都能诱导转基因拟南芥中GUS基因的上调表达,推测桑树在遭受胁迫时,Ma ACO启动子被激活,启动下游基因的转录表达,从而激活乙烯生物合成途径,促成乙烯生成,且桑树在逆境胁迫时,MnACO1启动子发挥更重要的作用,可将MnACO1基因作为改良桑树品种抗逆性靶基因。4.乙烯利与1-MCP处理对桑椹中Ma ACO基因表达的影响桑树盛花期后21天和26天,分别用乙烯利喷洒桑椹表面,采摘后桑椹经1-MCP熏蒸处理,测定其花青素和总糖含量,分析Ma ACO2以及花青素相关基因Ma DFR和Ma ANS的转录表达。桑椹经过乙烯利处理后,花青素含量和总糖含量与对照相比都有明显增加,与花青素合成有关的基因表达也受乙烯利上调,经1-MCP熏蒸的桑椹花青素含量和总糖含量与对照相比都有所下降。与对照相比,21DAF桑椹经乙烯利处理后,Ma ACO2表达量先上调后下调;26DAF桑椹经乙烯利处理后,Ma ACO2表达量在处理后8 h受到显著上调,处理后32 h,表达量高于对照;采后桑椹经1-MCP熏蒸,Ma ACO2基因的表达受到抑制。结果表明,Ma ACO2在桑椹成熟过程中的表达量受乙烯利和1-MCP调节,桑椹花青素和总糖含量的积累也随之改变,因此,Ma ACO2在桑椹成熟过程发挥重要作用。