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遗传基因作为性别分化的基础,提供了两性分化的可能性,而性分化则是在各种遗传基因和外部环境因子的相互作用下实现的。在本研究中通过外源激素甲基睾酮(MT)和温度处理半滑舌鳎获得性逆转个体,分析其中性别相关基因的表达变化情况有助于了解性别分化的作用机理。半滑舌鳎是近年来新开发的一种理想的增养殖对象,雌性个体生长速度比雄性快2-3倍。探索温度和MT对该鱼的性别决定和性别分化的影响,获得性逆转亲本,用于培育全雌后代,具有重要的应用前景和经济效益。1温度和MT对半滑舌鳎性腺分化的影响通过石蜡组织切片,对半滑舌鳎早期性腺分化进行组织学观察发现:在24℃饲养条件下,孵化后30d半滑舌鳎性腺开始分化,其中具有裂隙的性腺原基未来发育为卵巢,而不具裂隙的原基未来发育为精巢。在孵化后25-100d对半滑舌鳎进行不同温度(16℃、20℃、24℃、28℃、32℃)处理以及采用不同浓度梯度(20μg/L·H2O、30μg/L·H2O、50μg/L·H2O、80μg/L·H2O、100μg/L·H2O)的雄激素甲基睾酮(MT)浸浴处理,在9月龄时利用石蜡组织切片鉴定表型性别,观察温度和MT对性腺分化的影响,结果表明:28℃和32℃高温能显著提高群体中的雄性比例,分别达到69.2%(0.01<P<0.05)和66.7%(0.01<P<0.05);而低温16℃和20℃对性别分化影响不大,群体中雄性比例分别为56.5%(P>0.05)、57.1%(P>0.05);24℃处理群体中雌雄个体比例接近1∶1。在20μg/L·H2O、30μg/L·H2O、50μg/L·H2O、80μg/L·H2O、100μg/L·H2O的MT浸浴处理都能显著提高群体中的雄性比例,分别达到100%(P<0.01)、97.7%(P<0.01)、100%(P<0.01)、97.4%(P<0.01)、100%(P<0.01)。半滑舌鳎雌性特异的遗传性别鉴定技术也检测到高温处理组及MT处理出现了性逆转的雄性个体,这些结果表明在孵化后25-100d采用20-100μg/L·H2O浓度的甲基睾酮浸浴处理和28℃、32℃高温处理半滑舌鳎鱼苗,都能有效的诱导半滑舌鳎发生由雌性向雄性的性别逆转。2半滑舌鳎性腺型芳香化酶(tsP450aromA)基因和脑型芳香化酶(tsP450aromB)基因的克隆及表达分析采用同源克隆策略和RACE的方法,分别从半滑舌鳎卵巢和脑中分离了性腺型芳香化酶(tsP450aromA)和脑型芳香化酶(tsP450aromB)。tsP450aromA cDNA全长2266bp,该基因编码了526个氨基酸。氨基酸序列和系统发生分析表明,tsP450aromA属于卵巢型P450aromA,tsP450aromA的氨基酸序列与其它鱼类P450aromA的同源性较高(59%～77%),与脑型P450aromB的同源性较低(56%～60.7%)。Genome walking获得的启动子序列分析发现具TATA框和潜在的转录调节因子,包括半个雌激素应答元件(ERE half),两个Ad4-binding motifs。RT-PCR分析表明:tsP450aromA的表达具有明显组织特异性,tsP450aromA只在性腺中表达,且卵巢中表达量远高于精巢,而在雌雄鱼的其它组织中都不表达。在性腺发育过程中,精巢和卵巢中的芳香化酶的表达都逐渐增强,但卵巢中的表达量始终高于精巢。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性逆转为雄性后,性腺中芳香化酶的表达量降低。这些结果表明tsP450aromA参与了半滑舌鳎的性腺发育和性别决定过程。(tsP450aromB)cDNA全长2184 bp,该基因编码了498个氨基酸。氨基酸序列和系统发生分析表明,tsP450aromB属于脑型P450arom,tsP450aromB的氨基酸序列与其它硬骨鱼类的脑型P450aromB的同源性较高(48.3%～66.1%),与性腺型P450aromA的同源性较低(34.2%～49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1%。RT-PCR分析表明:tsP450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,tsP450aromB只在性腺、脑、鳃、皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其它组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中tsP450aromB的表达量降低,这些结果表明tsP450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。3半滑舌鳎FTZ-F1(tsFTZ-F1)基因的克隆及表达分析采用同源克隆策略和RACE的方法,从半滑舌鳎精巢分离了3143 bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(tsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框(ORF),66 bp长的5’末端非编码区(UTR), 1619 bp长的3’末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列、功能分析和系统发生分析表明:tsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:tsFTZ-F1 mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑、头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明tsFTZ-F1参与了半滑舌鳎的器官形成过程。经过甲基睾酮浸浴处理后,由雌性转变为雄性的性逆转雄性个体中,性腺中tsFTZ-F1和tsP450aromA的表达量降低。这些结果表明,tsFTZ-F1参与了半滑舌鳎的性别逆转过程,它的作用途径可能是作为转录调节因子,结合于芳香化酶的启动子实现对芳香化酶的表达调控。4半滑舌鳎DMRT1(tsDMRT1)基因的克隆及表达分析采用同源克隆策略和5’-RACE,从半滑舌鳎精巢分离了608 bp长的tsDMRT1基因cDNA的部分序列,含45 bp的5’-UTR和起始密码子,该片断包含了187个氨基酸残基,其中包括DMRT1基因保守的DM结构域。RT-PCR分析表明:tsDMRT1只在精巢中表达,其它组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性逆转为雄性后,精巢中tsDMRT1也有表达。这些结果表明tsDMRT1参与了半滑舌鳎的精巢分化过程。