分子间或分子内通过非共价键结合在一起形成的复合物为超分子。某些天然超分子通过自组装形成一种通常包括八面体、十二面体或者二十面体等不同的形状的壳结构,而这些壳结构为超分子提供了一些广泛的应用。其中之一就是用这些衣壳作为承载其他小分子的容器,包载物的衣壳在外界条件改变下将包裹的小分子释放出来发挥自身的功能,因此这些承载了外来分子的衣壳可以用在材料、酶学催化或者药物传递等多领域。酶不稳定且易降解的特点众所周知,如果用某种特定的壳将酶包裹起来就可以防止酶在发挥作用过程中外界条件对酶的影响。在药物传递领域,某些可以杀死细胞的毒性无机小分子或者生物大分子在杀死癌细胞的同时也会伤害正常细胞,如果用衣壳将其包裹,在传递的过程中就可以避免对正常细胞的伤害,到达特定靶位时释放包裹的分子,将癌细胞杀死从而提高生物性能。病毒是自然界中最常见的一种天然分子容器,使用病毒衣壳来传递药物也是近年来很常见也是很成熟的一种手段。除病毒外,许多非病毒的天然蛋白衣壳也可看作是承载小分子的容器。例如,在枯草芽孢杆菌中存在着一种由六十个亚基组成的具有十二面体衣壳结构的二氧四氢喋啶合酶（BsLS）,在衣壳内部包裹着一个三聚体的核黄素合酶（BsRS）。这个复合体结构中的二氧四氢喋啶合酶和核黄素合酶在核黄素合成的过程中具有重要作用。以前的研究学习曾报道过通过改变这个复合体所在的环境,会导致衣壳结构变大从而释放出核黄素合酶。这个天然的分子包裹并轻松释放的系统也许可以启迪我们来利用这个衣壳的优势包裹某些特定的小分子并在特定靶位释放以提高专一性。近年来,除了天然的超分子包裹系统,人们也曾尝试着构建具有高效包裹能力的衣壳。其中一种曾被修饰过用来包裹小分子的衣壳折叠工程就是来自超嗜热菌中的二氧四氢喋啶合酶（AaLS）,其由六十个亚基组成的内径为九纳米的十二面体聚合物。为了利用它来高效包裹外源分子,在一个修饰工程中通过氨基酸突变导致其重新组装为一个由一百八十个亚基组成的内部带有额外的负电荷扩大的衣壳,它就会优先包裹带有正电荷的外来分子。将其与在末端连有十个精氨酸短肽的HIV蛋白酶共表达,单体在成壳过程中就可以将带有正电荷的HIV蛋白酶包裹通过电荷互补作用。因此来自超嗜热菌中二氧四氢喋啶合酶为包裹装配工程提供了很有前景的应用平台。但是这个包裹系统只能通过电荷互补的方法包裹小分子,使其没有专一性;其次在氨基酸突变过程中会导致衣壳结构变大,使我们不能很清晰的了解结构内部;再次这种装配和解聚过程是不可逆的,使得包裹进去的分子不能释放,所以相比天然的枯草芽孢杆菌中的二氧四氢喋啶合酶复合体的包裹释放系统,这种天然的更值得人们利用。尽管有不少关于枯草芽孢杆菌中二氧四氢喋啶合酶复合体衣壳结构和功能的研究,但目前为止还不知道复合体内部核黄素合酶的结构,这个信息的缺少阻碍了人们去探索核黄素合酶如何被二氧四氢喋啶合酶包裹。通过比较,发现在大肠杆菌中也存在着二氧四氢喋啶合酶和核黄素合酶,与枯草芽孢杆菌中的两种酶属于两对同源蛋白,大肠杆菌中二氧四氢喋啶合酶也是由六十个亚基组成的十二面体的衣壳。大肠杆菌中核黄素合酶的结构已被报导,它是一种类似于蘑菇形状的三聚体,每个单体都包含两个β折叠和一个α螺旋,最后7个氨基酸在结构中看不到,我们猜测它是一段灵活的序列,在结构中能看到的后面21个氨基酸形成α螺旋。然而在大肠杆菌中二氧四氢喋啶合酶不能包裹核黄素合酶。比较两种核黄素合酶的氨基酸序列,尽管它们有30%的同源性,但它们的末端氨基酸序列完全不一样,而且枯草芽孢杆菌中的核黄素合酶比大肠杆菌中的同源蛋白长四个氨基酸。鉴于大肠杆菌中核黄素合酶的结构分析,枯草芽孢杆菌中核黄素合酶的最后11个氨基酸也可能是个灵活的尾巴,最后32个氨基酸也可能构成α螺旋。我们推测可能末端的α螺旋序列或者结构中看不到的那段序列导致枯草芽孢杆菌中的核黄素合酶被二氧四氢喋啶合酶包裹。因此我们的任务就是将末端的32个氨基酸以及最后11个氨基酸融合到绿色荧光蛋白,将融合后的绿色荧光蛋白与二氧四氢喋啶合酶共表达,通过荧光检测来确定衣壳合酶能否将融合了核黄素合酶标签的蛋白包裹。这个课题的目标就是探究枯草芽孢杆菌中核黄素合酶（BsRS）为什么能被二氧四氢喋啶合酶（BsLS）包裹并且利用这个天然的系统包裹外源蛋白。合成枯草芽孢杆菌中核黄素合酶的最后11个及后32个氨基酸序列,使其末端磷酸化并通过PAGE的方法纯化。选用带有十个精氨酸的绿色荧光蛋白（GFP）质粒作为模板,通过用XhoI和SpeI两种酶进行酶切,去磷酸化酶将末端的磷酸基团去掉以防止模板自连,将模板纯化后在T₄DNA连接酶的作用下与寡核苷酸对连接得到构建的质粒。反应得到的产物通过热击转化进入感受态细胞DH5α,将菌液涂在含有氯霉素的固体培养基平板上,在37°C培养箱过夜培养。平板上会出现多个单克隆,挑取一个单克隆放进五毫升的培养基中过夜培养,用公司提供的质粒小提试剂盒提取质粒,将提取的质粒送往生物公司测序。将11和32个氨基酸分别融合在绿色荧光蛋白（GFP）上后得到了GFP11和GFP32。用同样的方法将质粒转化到感受态细胞BL21（DE3）,将含有质粒的细胞液涂在固体培养基平板上,在平板上挑取单克隆过夜培养,过夜细胞液加入到五百毫升的液体培养基在摇床培养四个小时左右,OD₆₀₀值约达到0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）后过夜诱导,通过离心将收集得到细胞碎片。用细胞裂解缓冲液重悬细胞碎片,冰浴中通过酶裂解以及超声破碎后后离心,40%的饱和硫酸铵溶液与离心后的上清液在室温反应三十分钟以出去某些杂蛋白,最后再通过离心得到上清液在低盐缓冲液中过夜透析以出去硫酸铵。过滤后用阴离子交换柱梯度洗脱,收集浓缩目标蛋白,最终通过分子筛柱来分离得到纯蛋白。对于非共表达的二氧四氢喋啶合酶（BsLS）的生产与GFP相似,唯一不同的是BsLS的抗生素是氨苄西林。而纯化的过程中不需要加饱和硫酸铵而是六十度条件下加热五分钟使杂蛋白沉淀,得到上清液后用阴离子交换柱以及分子筛来纯化得到。分别将BsLS与GFP11,GFP32,GFP0共表达在培养基中加入氯霉素和氨苄西林两种抗生素,纯化方式与单独表达的BsLS方式一样。在此过程中共生产和纯化了七种蛋白（GFP0,GFP11,GFP32,BsLS,BsLS+GFP0,BsLS+GFP11,BsLS+GFP32）。通过分子筛孔径分析可以知道每种蛋白的相对形状。两毫克纯化后的蛋白上样到分子筛柱,检测从柱子上流出的每一部分的荧光强度以及在280纳米处的紫外吸收。结果显示单独表达的的三种GFP在很低的浓度下就有很高的荧光强度,它们在分子筛柱的流出体积是一百毫升;对于衣壳蛋白BsLS以及与衣壳共表达的BsLS+GFP0,BsLS+GFP11和BsLS+GFP32,它们在分子筛柱的流出体积都是七十毫升,这表明与三种GFP共表达后并没有影响衣壳BsLS本身的结构与大小。共表达的BsLS+GFP11和BsLS+GFP32在七十毫升处出现了明显的荧光强度,而BsLS+GFP0在相同体积处几乎没有可以检测到的荧光强度。这表明了加了BsRS末端序列的GFP11和GFP32能被衣壳BsLS包裹而未加任何修饰的GFP0则不能被包裹。此外酶联免疫反应实验采用的抗GFP的抗体来捕捉自由的GFP,结果进一步证明加了BsRS末端序列的GFP是藏在BsLS衣壳内部。为了检测BsRS短肽序列标签是否会影响野生型GFP的荧光强度,通过荧光检测器扫描了三种GFP的荧光波长,不难发现这三种GFP的荧光波普形状都一样,都在508纳米处有最大的荧光吸收。但是相同浓度的三种GFP在508纳米处的荧光强度有一定程度的不同,GFP11和GFP32分别比GFP0低了14%及44%。借助GFP的荧光特性,得到关于三种GFP在508纳米处荧光强度与对应浓度的标准曲线,以相同条件测量共表达复合物的荧光强度,减去背景吸收后根据其对应的荧光强度得出在每种复合物中包含的荧光蛋白数量。此种计算方法得出1.3个GFP11,0.5个GFP32以及0.08个GFP0被衣壳包裹。此外还运用了SDS-PAGE的方法来计算包裹产率,用ImageJ根据灰度值比率来确定荧光蛋白在衣壳中的数量。这种计算方式得到的包裹产率为每个衣壳可以包裹1.1个GFP11及0.5个GFP32,包裹产率与荧光分析法得到的结果基本一致。为了验证BsRS末端这段短肽对BsLS具有专一性,将GFP11与BsLS的同源蛋白AaLS共表达,通过分子筛孔径分析发现其在分子筛柱的流出体积也为七十毫升,检测每一部分的荧光强度和在280纳米处的吸收,结果发现AaLS与GFP11的衣壳复合体几乎没有荧光强度,说明这段标签对于BsLS具有专一性,不能被其他衣壳包裹。将这11个氨基酸以及HA标签融合到蓖麻毒素蛋白A链上（Abrin A）,这是一种抑制核糖体活性且分子量与GFP相似的毒性蛋白,构建可以表达蓖麻毒素蛋白的质粒后与BsLS共表达,以与BsLS+GFP11相同的方式生产和纯化,Western blot的方式来计算包裹产率。选用抗HA标签的抗体来特异性的捕捉到含有HA标签的蓖麻毒素蛋白,根据不同浓度的蓖麻毒素蛋白对应的不同灰度值构建一条标准曲线,衣壳复合体出现的灰度值代表着蓖麻毒素蛋白的量,在标准曲线上计算得到每个衣壳蛋白可以包裹1.3个蓖麻毒素蛋白,与荧光蛋白的包裹产率相迎合。因此得出这段BsRS末端包裹标签对于外源蛋白被BsLS包裹是广泛应用的,它可以融合到多种蛋白上,与BsLS共表达时被包裹。将BsLS+GFP11复合体原来所在的磷酸盐缓冲液改变成Tris-HCl缓冲液,并将pH值提高到8.0,通过分子筛柱检测到BsLS体积变大,GFP11释放。此外,电镜结构分析也能观测到BsLS直径由十六纳米增大到二十六纳米的变化通过改变缓冲液的条件。在很温和的条件下BsLS体积变大并且释放被包裹的分子GFP11,但是将BsLS与过量的GFP11混合并在Tris-HCl缓冲液中培养两天后转入使BsLS稳定的缓冲液中（磷酸盐缓冲液）,通过分子筛分析每种蛋白的流出体积,检测每一部分的荧光强度和在280纳米处的吸收,在BsLS流出体积部分没有检测到任何荧光,而在GFP11流出体积部分依然有很强的荧光。因此在体外的培养不能使变大的BsLS将GFP11包裹,并且膨胀的BsLS也不能变回原来的体积,因此这个过程是不可逆的。以上证明BsRS末端序列可以融合到多种外源蛋白并高效地被BsLS包裹,在温和的外界条件改变下可以释放被包裹的分子。很好的例子就是BsLS将蓖麻毒素蛋白包裹,将来可以用于药物传递。蓖麻毒素蛋白在杀死癌细胞的同时也会伤害正常细胞,衣壳蛋白将其包裹后可能会赋予它特殊性,让衣壳在特定的靶位释放毒蛋白杀死细胞以提高生物利用性;除了药物传递,还可以用衣壳来包裹酶,防止酶的降解并提高酶活力;在很温和的条件下衣壳可以释放被包裹的小分子,这个优点更加强了它的应用,因此为以后包裹及释放系统的发展提供了很有前景的应用平台。